P nos imunofenotypizace k diferenci ln diagnostice hematoonkologick ch onemocn n
Download
1 / 24

Přínos imunofenotypizace k diferenciální diagnostice hematoonkologických onemocnění - PowerPoint PPT Presentation


  • 82 Views
  • Uploaded on

Přínos imunofenotypizace k diferenciální diagnostice hematoonkologických onemocnění. M.Bílý, K. Klaricová, L.Novosadová, D. Starostka, M. Wróbel Oddělení klinické hematologie NsP Havířov Prim. MUDr. L. Novosadová. Y. Y. mab2 PE. mab1 FITC. Imunofenotypizace.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Přínos imunofenotypizace k diferenciální diagnostice hematoonkologických onemocnění' - griffith-trujillo


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
P nos imunofenotypizace k diferenci ln diagnostice hematoonkologick ch onemocn n

Přínos imunofenotypizace k diferenciální diagnostice hematoonkologických onemocnění

M.Bílý, K. Klaricová, L.Novosadová,

D. Starostka, M. Wróbel

Oddělení klinické hematologie

NsP Havířov

Prim. MUDr. L. Novosadová


Imunofenotypizace

Y hematoonkologických onemocnění

Y

mab2PE

mab1 FITC

Imunofenotypizace

Typizace jednotlivých buněčných populací za využití

reakce antigen – protilátka. Reakce je vizualizována

označením protilátky fluorochromem (FITC, PE, PC5, aj.).

Zjištění imunofenotypu dané populace.

Buněčná lokalizace antigenů (markerů, znaků):

  • Povrchová (membránová).

  • Intracytoplazmatická.

  • Nukleární (jaderná).

    Zdroje vyšetřovaného materiálu v hematologii:

  • periferní krev

  • kostní dřeň

  • tělesné tekutiny (punktáty, likvor, aj.)

  • suspenze buněk ze solidních tkání po dezintegraci

    Praktické provedení imunofenotypizace:

  • Průtoková cytometrie.

  • Fluorescenční mikroskopie.


Mo nosti v cebarevn ho zna en multiparametrov anal za
Možnosti vícebarevného značení (multiparametrová analýza)

  • V jedinézkumavce vyšetřované buňky + 2 či více protilátek proti různým znakům, každá protilátka označena jiným flurochromem.

  • Současná analýza exprese několika znaků na jedné buňce.

    Význam:

    Získání upřesňujících informací

    o charakteru vyšetřované populace,

    konfirmace diagnózy.

    Příklad:

    Znaky CD19 (B-lymfocyty) a CD5

    (fyziologicky T-lymfocyty)

    u B-CLL : patologická subpopulace

    CD19+CD5+ .


P ehled cd znak cd c luster of d ifferentiation
Přehled CD znaků ( analýza)CD = Cluster of Differentiation)

  • T – lymfocyty :

    CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD2, CD1 , TCR

  • B – lymfocyty :

    CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD38,

    CD11c, CD79b, FMC7, CD40, CD28, CD103, CD138

  • NK – buňky: CD16, CD56

  • Granulocyty a monocyty:

    CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD33

  • Progenitorové buňky: CD34, CD38, CD117

  • Povrchové, event.intracytoplazmatické imunoglobuliny : těžké řetězce IgG, IgA, IgM, IgD, lehké řetězce κ, λ


Pr tokov cytometrie flow cytometry
Průtoková cytometrie (flow cytometry) analýza)

  • Metoda kvantitativní a kvalitativní analýzy buněčných či jiných částic, pohybujících se v proudu tekutiny, která protéká v průtokové komůrce přes laserový paprsek.

  • Identifikace různých buněčných typů uvnitř smíšené buněčné populace, analýza jednotlivých subpopulací v rámci jedné populace.

  • Rychlá, přesná a reprodukovatelná metoda, umožňující současné měření několika parametrů až na 104 buněk za 1 sekundu.


Sch ma pr tokov ho cytometru

675BP FL4 (PC5) analýza)

620BP FL3 (ECD)

575BP FL2 (RD1)

525BP FL1 (FITC)

Laser (Air-cooled Argon Ion Laser)

Detektor pro

„Side Scatter“

645DL

600DL

550DL

488BK

Čočky upravující tvar paprsku

„Beam Shaping Lenses“

488DL

Detektor pro

„Forward Scatter“

Průtoková kyveta

„High Sensitivity

Quartz Flow Cell“

Schéma průtokového cytometru


Klinick aplikace imunofenotypizace v hematologii a hematoonkologii
Klinická aplikace imunofenotypizace analýza)v hematologii a hematoonkologii

  • Analýza erytrocytů

  • Analýza trombocytů

  • Stanovení retikulocytů

  • Funkční vyšetření granulocytů

  • Vyšetření diferenciálního rozpočtu leukocytů

  • Typizace leukémií: AL – AML, ALL

    chronické leukémie (např. CLL)

  • Typizace lymfomů - v leukemické fázi

    - vyšetření lymfatických uzlin, sleziny

  • Imunofenotypizace dalších jednotek: myelom, MDS, PNH

  • Analýza onkoproteinů

  • Sortování (třídění) buněk dle antigenní výbavy

    (progenitorové buňky CD34)

  • Cytometrická DNA analýza (ploidie, obsah DNA, RNA)


P ehled hematoonkologick ch diagn z 1 1995 2 2002
Přehled hematoonkologických diagnóz 1/1995 – 2/2002 analýza)

Celkem vyšetřeno 4350 jednotlivých vzorků, tj. 49 870 znaků.


Definice lymfocyt zy
Definice lymfocytózy: analýza)

Zvýšení počtu lymfocytů v periferní krvi

  • absolutní > 4.0 x 109 / l u dospělých

  • relativní

    Diferenciální diagnostika pomocí membránových znaků:

  • monoklonální ( primární, leukemická) lymfocytóza

  • polyklonální ( sekundární, reaktivní ) lymfocytóza

    Důležitost rozlišení patologické lymfocytózy od reaktivní.


Monoklonalita v lymfoidn ch ad ch z pohledu imunofenotypu
Monoklonalita v lymfoidních řadách analýza)(z pohledu imunofenotypu)

B-linie

1. Lehké řetězce imunoglobulinůkappa, lambda.

Průměrný poměr 1.5 : 1 . Normální rozsah 0.7-2.5 .

Monoklonalita κ:λ , λ:κ> 3:1 .

2. Těžké řetězce imunoglobulinů ( molekuly Ig).

Monoklonalita: 1 Ig třída k součtu ostatních

>3:1 .

3. Charakteristický imunofenotyp


Monoklonalita v lymfoidn ch ad ch z pohledu imunofenotypu1
Monoklonalita v lymfoidních řadách analýza)(z pohledu imunofenotypu)

T linie:

1. Zvýšená exprese pan-T antigenů.

2. Exprese aberantních fenotypů, uniformní imunofenotyp.

3. Porušený poměr CD4/CD8.

4. Typ TCR.

5. Délka trvání T- lymfocytózy ( absolutní počet >4.0 x 109/l po dobu minim. 3 - 6 měsíců ).


Imunofenotyp u chronick ch b lymfoproliferac
Imunofenotyp u chronických B - lymfoproliferací analýza)

Legenda: B – CLL : B – chron. lymf. leukémie MCL : mantle – cell lymfom

B – PLL : B – prolymfocyt. leukémie FL : folikulární lymfom

HCL : hairy – cell leukémie MZL : lymfom z marginální zóny

HCL – V : HCL – variant LPL : lymfoplazmocytoid. lymfom (imunocytom)

PCL : plazmocelulární leukémie SLVL : splenický lymfom s vilóz. lymfocyty

WM : Waldenström. makroglobulinémie ND : neudáno


Sk rovac syst m pro b cll podle matutes a spol
Skórovací analýza)systém pro B – CLL(podle Matutes a spol.)

Rozmezí skóre od 5 (typická B - CLL) do 0 (atypická B - CLL).


P ehled stav diagnostikovan ch na okh nsp hav ov od 6 1997 do 2 2002
Přehled stavů diagnostikovaných na OKH NsP Havířov od 6/1997 do 2/2002

Vyšetřeno 249 pacientů s nově zjištěnou absolutní

lymfocytózou ( > 4.0 x 109 / l lymfocytů v perif. krvi ).

Soubor pacientů:

  • 249 dospělých pacientů ve věku od 19 do 98 let

    ( průměrný věk 64.9 let )

  • Poměr muži : ženy 145 : 104 ( 1.39 : 1 )

  • Počet leukocytů v KO: 5.4 – 536.0 x 109 / l

  • Lymfocyty v diferenciálním rozpočtu: 0.04 - 0.99 numfr

  • Absolutní počet lymfocytů: 4.1 – 530.0 x 109 / l

  • Převaha řetězců κ : λ 145 pacientů - poměr 1.1 - 776 : 1

  • Převaha řetězců λ : κ 100 pacientů - poměr 1.1 - 829 : 1


P ehled stav s absolutn lymfocyt zou diagnostikovan ch na okh nsp hav ov od 6 1997 do 2 2002
Přehled stavů s absolutní lymfocytózou diagnostikovaných na OKH NsP Havířov od 6/1997 do 2/2002

( n = 249 )


Stavy bez absolutn lymfocyt zy s po tem lymfocyt 4x10 9 l
Stavy bez absolutní lymfocytózy, diagnostikovaných na OKH NsP Havířov s počtem lymfocytů < 4x109/l

Vyšetřeno 18 pacientů bez absolutní lymfocytózy

( < 4.0x109 /l lymfocytů v periferní krvi ), u kterých

vedla imunofenotypizace k dg. lymfoproliferace.

Soubor pacientů:

  • 18 dospělých pacientů ve věku od 41 do 79 let

    ( průměrný věk 63.6 let )

  • Poměr muži : ženy 10 : 8

  • Počet leukocytů v KO: 2.5 – 14.2 x 109 / l

  • Lymfocyty v diferenciálním rozpočtu: 0.15 - 0.78 numfr

  • Absolutní počet lymfocytů: 1.1 – 4.0 x 109 / l

  • Převaha řetězců κ : λ 14 pacientů - poměr 2.8 – 69 : 1

  • Převaha řetězců λ : κ 4 pacienti - poměr 4.4 – 86 : 1


Stavy bez absolutn lymfocyt zy s po tem lymfocyt 4x10 9 l1
Stavy bez absolutní lymfocytózy, diagnostikovaných na OKH NsP Havířov s počtem lymfocytů < 4x109/l

( n = 18 )


Kazuistika 1
Kazuistika č.1 diagnostikovaných na OKH NsP Havířov

B.D., M, 60 let

  • V dubnu 2000 náhodně zachycená extrémní leukocytóza na bázi lymfocytózy.

  • Krevní obraz: hemoglobin 125 g/l

    leukocyty 485x109/l

    trombocyty 96x109/l

    diff.: lymfocyty 0.91 numfr

    lymfocyty absolutně 441 x 109/l

    Imunofenotypizace lymfocytů (4/2000):

    CD 19+98.5 % SmIgM 91.5 %

    CD 19+/5+98.4 % SmIgD90.4 %

    CD 23+78.6 % CD 19+/+ 92.7 %

    CD 79b+82.0 % CD 19+/+ 0.3 %

    FMC 7+5.0 %Poměr /309 : 1

    Závěr: B-CLL, skóre dle Matutes a spol. 3/5.


Kazuistika 2
Kazuistika č.2 diagnostikovaných na OKH NsP Havířov

C.K., M, 63 let Před léčbou Po léčbě

  • Dg. B-CLL od 6/1997, skóre B-CLL 4/5.

  • Léčba nejprve chlorambucilem (Leuke-

    ran), poté fludarabinem ( 5 kúr, 2/2000-

    7/2000)

    Charakteristika Před léčbou Po léčbě

    lymfocytů fludarabinem fludarabinem

    Leukocyty (109/l) 149.8 3.3

    Lymf. diff.(numfr) 0.92 0.31

    Lymf. absol. (109/l) 137.8 1.0

    CD 19+ 87.5 % 91.2 %

    CD 19+/5+ 87.5 % 91.2 %

    CD 23+ 81.0 % 85.2 %

    CD 19+/+ 1.6 % 0.3 %

    CD 19+/+ 90.7 % 87.2 %

    Poměr / 57 : 1 291 : 1

    Závěr:

    I přes leukopenii a lymfopenii není po léčbě B-CLL

    remise na úrovni imunofenotypu dosaženo !


Kazuistika 3
Kazuistika č. 3 diagnostikovaných na OKH NsP Havířov

J. K., M, 42 let

  • V 5/2001 při preventivní prohlídce zjištěna trombocytopenie, leukocyty početně v normě,

    v diff. lymfocytóza. Dále splenomegalie.

    Cytomorfologicky některé lymfocyty s vilózními výběžky, pojato podezření na HCL.

  • KO v 5/2001: Hb 171 g/l

    leuk. 5.4 x 109/l

    tromb. 53 x 109/l

    diff.: segm. 0.14

    ly 0.82, mo 0.04 numfr

    Imunofenotypizace patologických buněk PK:

    CD19 89.5% CD19+/κ+ 4.8%

    CD11c 94.1% CD19+/λ+ 75.6%

    CD22 86.7%

    CD25 81.6%λ : κ= 16 : 1

    CD103 88.3%

    CD5 8.8% SmIgG 90.8%

    CD23 6.4% SmIgA 79.5%

    Závěr: Vlasatobuněčná leukémie (HCL).

    (Potvrzeno histologií kostní dřeně.)


Z v ry i
Závěry I. diagnostikovaných na OKH NsP Havířov

  • Imunofenotypizace představuje u hematoonkologických onemocnění zásadní diagnostickou a diferenciálně diagnostickou metodu. Multiparametrová analýza buněk zvyšuje přesnost diagnózy a lépe charakterizuje imunofenotyp vyšetřované populace.

  • Jednotlivé hematoonkologické jednotky se vyznačují poměrně charakteristickým až zcela diagnostickým imunofenotypem, který může mít i prognostický význam a jehož lze např. využít k průkazu relapsu onemocnění a monitoraci minimální reziduální choroby.

  • Imunofenotypizace průtokovou cytometrií se vyznačuje vysokou senzitivitou a specifitou (citlivost metody cca 10-3 buněk), rychlostí a reprodukovatelností.


Z v ry ii
Závěry II. diagnostikovaných na OKH NsP Havířov

  • Při záchytu absolutní lymfocytózy, zejména perzistující, je nutné vyloučit monoklonální charakter lymfoidní populace. K tomuto účelu se jeví imunofenotypizace ve většině případů jako suverénní diagnostická metoda, která často objasní monoklonalitu i u lymfoproliferací s relativní lymfocytózou.

  • Vysoká senzitivita i specifita při stanovení imunofenotypu buněk vede často k odhalení patologického lymfoidního klonu podstatně dříve než při vyšetření dalšími běžnými metodami.

  • Pacient s monoklonální lymfocytózou by měl být komplexně vyšetřen. U dosud nevyhraněného imunofenotypu jsou nutné dispenzarizace a kontroly.


Spolupracuj c pracovi t

FNsP Ostrava: ÚKH diagnostikovaných na OKH NsP Havířov

Interní klinika

NsP Karviná – Ráj: HTO

Interní oddělení

Oddělení TRN

ORL oddělení

Karvinská hornická

nemocnice, a.s. : Interní oddělení

Nemocnice Třinec : Interní oddělení

HTO

Krevní centrum

Frýdek - Místek

Nemocnice Hranice : HTO

Nemocnice

Frýdek – Místek : HTO

Interní oddělení

Urologické odd.

Odd. následné péče

Nemocnice Bohumín : Interní oddělení

Chirurgické odd.

Městská nemocnice

Český Těšín : OKBH

Interní oddělení

Nemocnice Orlová

a LDN : Interní oddělení

Neurologické odd.

LDN

Praktičtí lékaři

Spolupracující pracoviště


ad