Bâtiment Grégor Mendel - 43, boulevard du 11 novembre 1918 69 622–VILLEURBANNE Cedex tél : 0472431377 - fax : 0472431

1. - Symbiose actinorhizienne - Symbiose mycorhizienne - Interactions rhizosphèriques - Transfert de gènes et adaptation bactérienne - Groupes fonctionnelles du cycle de l’azote - Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement Bâtiment Grégor Mendel - 43, boulevard du 11 novembre 1918 69 622–VILLEURBANNE Cedex tél : 0472431377 - fax : 0472431223 Université Claude Bernard Lyon 1UMR CNRS 5557USC INRA 1193 Méthylation et métalloïdes toxiques B. Cournoyer

2. Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques • plusieurs bactéries pathogènes = résistantes au tellurite • et/ou sélénite: • - P. syringae, Agrobacterium tumefa ciens • - P. aeruginosa, E. coli VTEC, Salmonella typhimurium • - Staphylococcus aureus Odeur d’ail réduction K2TeO3 4ppm  Pourquoi? Quel mécanisme? Méthylation?

3. - - pSK pSK orfC-like tpmE htpX-like Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques • Identification de la bTPMT (Cournoyer, 1996) • P. syringae Odeur d’ail = DMTe HincII HincII EcoRI EcoRI EcoRI XhoI SmaI PstI 0.92 1.65 T3 LB T7 0 1 2 E. coli ::tpmE + sélénite K2TeO3 4ppm  E. coli TPMT-E Analyse GC-MS (Ranjard et al., 2000)

4. Caractérisation de la bTPMT • Caractéristique du déterminant: • - forte homologie avec la thiopurine méthyle transférase (TPMT) humaine (30% identités; 55% similarités) • Gmelin (1824): odorous materials obtained from Se et Te during animal experiments; a garlic-like odour (première observation) • - Idem chez l’Homme lors d’intoxication au Se et Te

5. Métabolisme des thiopurines • Fin des années 80, la TPMT est montrée essentielle pour le métabolisme des pro-drogues « 6-mercaptopurine » et • « thioguanine nucleotides » Krynetski & Evans, Oncogene, 2003 HPTR: hypoxanthine phosphoribosyltransferase Autres fonctions chez l’Homme - détoxication de métalloïdes???

6. Suite des travaux sur les bTPMT Introduction de toxiques (As, Se, Te, etc) dans l’environnement Produits volatils observés e. g. DMSe, DMDSe, DMSSe, etc GC-MS Sol (10 g) Présence de bTPMT ??

7. Détection des gènes de la bTPMT • Stratégie mise en place - élaboration d’un crible PCR / utilisation des domaines conservés TPMT-E vs huTPMT (30% identités; 55% similarités) TPMT-E 43 127 1 216 AA 78 AA 234 bp détection de tpm dans les ADN méta-génomiques des sols et des eaux

8. A B Diversité des bTPMT C D * E F G (eubacteria) H UbiG I J uniquement chez 30% des g-proteobacteria K L M bTPMT N O • - plus de 50% de • similarités • plusieurs allèles • par lignée P Q R S T U • = sol (7) V = b, Bordetella spp. X • * Homme, Rat, Souris TPMT UNK (b et g-proteobacteria) Publication: Favre-Bonté et al., 2005 + ms en cours de rédaction

9. kDa 116 66.2 45 35 25 18.4 14.4 TPMT-E Avant Après GST M Affinité des bTPMT pour les métalloïdes Avant induction Après induction Extrait soluble TPMT G3 TPMT G1 Marqueurs TPMT G2 TPMT-E TPMT-G Coupure de l’His tag Chromatographie d'affinité : TPMT-G : Ni-NTA (élution par 250 mM imidazole) TPMT-E : Glutathione-Sepharose-4B (élution par 10 mM glutathion)

10. 1 Courbe 1 Courbe 2 0,9 Courbe 3 0,8 DO320 Courbe 4 0,7 0,6 Courbe 5 0,5 0 10 20 30 40 50 60 Temps (min) Affinité des bTPMT pour les métalloïdes • Mise au point des tests enzymatiques • . tampon de réaction (selon Krynetski et al., 1995) • . choix du substrat – 6-mercaptopurine TPMT . Immuno-suppresseur (lors des greffes) . Traitement de la leucémie, et . Maladie auto-immune DO 320 10 µM TPMT-E Paramètres cinétiques de méthylation de la 6-MP par TPMT-E et les 3-TPMT-G. huTPMT, Km= 10.6 mM Activité de méthylation de la 6-MP

11. SeH Affinité des formes enzymatiques pour les toxiques séléniés • méthylation de substrats séléniés: 6-séléno-purine, Se-cystine, sélénite et • séléniate • . avec des extraits de protéines totales TPMT+ • - obtention de DMSe à partir de Se-cystine • - absence d’activités avec le sélénite • . en cours, comparaison des affinités et vitesse de réaction entre • mercaptopurine et séléno-purine DO 350

12. bTPMT Thiopurine (anti-métabolites de la synthèse des purines) • - utilisation répandue pour le traitement de maladies auto-immunitaires, de la leucémie, du cancer et prévention des rejets d’organes transplantés Substrats de la méthyle transférase bTPMT CH3SeCH3 S, Se, Te – inorg. et org. Autres produits: DMS, DMDS, DMDSe DMSeS, DMTe SAM SAH bTPMT

13. bTPMT et l’As? La piste des odeurs • Bartolomeo Gosio (1892): obtained a garlic like odor from microbes growing on a potato mash containing arsenic trioxide • + Scopulariopsis brevicaulis (Gosio’s fungi): • Gosio’s garlic-like gas (TMA) from As • mercaptan-like odour (DMSe) from selenite • garlic-like odour (DMTe) from tellurite

14. Méthylation bactérienne de l’As (en aérobiose) • Etat des lieux: • E. coli + DMA = TMAO (trimethylarsine oxide) • - Nocardia + MMA = (CH3)nAsH3-n (les méthyle arsines) • Bactéries TPMT +: • Pseudomonas sp. + arséniate = (CH3)2AsH • Aeromonas et Alcaligenes + méthyle arsoniate (MMA)= (CH3)AsH2 et (CH3)2AsH As dans l’environnement Produits volatils observés - MeAs, DMeAs, TMeAs « There are apparently no accounts of the characterization of specific arsenic methyltransferases from microorganisms » (Bentley and Chasteen, 2002)

15. Autres As métalloïdes-méthyle transférases ? • Les pistes: • 1. Les proches voisins de la TPMT • - UbiG (demethylubiquinone methyltransferase) • « UNK » (putative methyltransferases) • 2. Les UbiE et MMT (métalloïdes méthyle transférases) • - Découverte simultanée – nouvelle famille de Se/Te-méthyltransférases UbiE MMT Se-méthylation • large distribution • plusieurs duplications • synthèse de métabolites • secondaires dont • certains antibiotiques et • certaines molécules • anti-cancéreuses • présence dans les eaux • Ensemble • des eubacteries pas Se-méthylation Ranjard et al., 2004

16. Conclusions: • Plusieurs observations laissent entrevoir un rôle de la TPMT • dans la méthylation de l’As • Les formes méthylées de l’As sont obtenues dans les conditions • d’expression de la TPMT ou chez des organismes TPMT+ • 3. D’autres méthyle transférases pourraient jouer un rôle: • UbiG, certaines methyle transférases putatives, …et MMT • Même famille - plusieurs lignées (23) • chez les g-protéobactéries • structures différentes • substrats différents?

17. Perspectives • Voies de méthylation de l’As • - Recrutement d’un étudiant M2 • e. g. • . les formes de bTPMT et la méthylation de substrats arséniés • . Analyse comparative des affinités pour les substrats « S », « Se », • « Te » et « As » • * Recherche partenaire au sein du GDR-As (co-encadrement du M2) • pour le volet chimie analytique (détection/caractérisation des • formes méthylées)

18. Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement Participants: L. Champier S. Favre-Bonté L. Ranjard C. Prigent-Combaret + qqes stagiaires C. Monnez E. Brothier S. Favre-Bonté S. Nazaret B. Cournoyer • Remerciements: • ToxNuc-Environnement • CNRS – UCBL - ENVL • Région Rhône-Alpes

19. ++ (?) ++ (?) Méthylation de l’A s MeAs DMeAs Excrété dans les urines + 0 + ++ Methyl- arsonate Trimethyl- arsine oxide (TMAO) Dimethyl- arsinate arsenate AsH3, +++++ • Inorganic forms of arsenic are more toxic than organic forms • - Trivalent forms are more toxic than pentavalent arsenite Methyl- arsonite Dimethyl- arsinite Trimethyl- Arsine (TMA) +++ ++++ 0 (selon Cullen et Bentley, 2005) 0 (According to Challenger (1951)) AsH3 gaz, As(-III) > As(III) > As (V) > composés méthylés