J Świerkot, R Ślęzak, P Karpiński, J Pawłowska, L Noga

1. J Świerkot, R Ślęzak, P Karpiński, J Pawłowska, L Noga Określenie roli polimorfizmów genów uczestniczących w metabolizmie MTX na skuteczność terapii i działania niepożądane u chorych na RZS Akademia Medyczna we Wrocławiu Klinika Reumatologii i Chorób Wewnętrznych Zakład Genetyki

3. Polimorfizm genetyczny • Ford – 1940 rok • występowanie więcej aniżeli jednego prawidłowego allelu dla określonego locus genowego, z częstością większą niż 1% • polimorfizm może występować na wielu poziomach i dotyczyć różnorodności: • sekwencji DNA, • sekwencji aminokwasowych, • struktur chromosomalnych.

5. Polimorfizm pojedynczego nukleotydu • 99,9% sekwencji DNA jest u ludzi identyczna • różnice pojedynczego nukleotydu w danej pozycji = SNP • single nucleotidpolimorphism. • 1 na 300 nukleotydów wykazuje zmienność międzyosobniczą • większość znajduje się w tzw. obszarach niekodujących

6. TheHumanGenomeDiversity Project • Od kilkunastu lat realizowany jest międzynarodowy Projekt Poznania Różnorodności Genomu Ludzkiego • w 2003 roku w bazie tej zarejestrowano ok. 6 mln SNP • w styczniu 2005 było już 21 mln SNP

7. Zmiany sekwencji DNA w regionie kodującym lub regulatorowych genów mogą zmieniać: • strukturę białka • modyfikować aktywność enzymów • wpływać na ekspresję informacji genetycznej • oddziaływać na mechanizmy kontrolne biorące udział w podziale i rozwoju komórki

8. Wpływ genów na efektywność terapii gen lek Absorbcja Dystrybucja Metabolizm Wydzielanie stężenie lek gen Działania niepożądane komórka receptor G-proteina > lub < skuteczności gen gen

9. Cel pracy • Określenie roli wybranych markerów klinicznych i biomarkerów ze szczególnym uwzględnieniem wpływu polimorfizmów genów: • MTHFR C677T i A1298C,(reduktaza metylenotetrahydroflianowa) • RFC1 A80G, (przenośnik zredukowanych folianów) • TYMS 2R/3R i 6bp ins/del, (syntazatymidylanowa) • GGH C401T, (hydrolaza foliowielogammaglutaminianowa) • TC P259R, TC I219L, TC L376S i TC M198T na skuteczność i działania niepożądane w trakcie terapii metotreksatem u chorych na RZS.

10. RFC - przenośnik zredukowanych folianów GGH- hydrolaza foliowielogammaglutaminianowa TYMS- syntaza tymidylanowa MTHFR- reduktaza metylenotetrahydroflianowa ATIC - transformylaza rybonukleotydowa 5-amino-4- karboksyamidu DHFR-reduktaza dihydrofolianowa

11. RFC - przenośnik zredukowanych folianów GGH- hydrolaza foliowielogammaglutaminianowa TYMS- syntaza tymidylanowa MTHFR- reduktaza metylenotetrahydroflianowa TC - transkobalamina

12. Materiał i metody • 270 chorych na RZS spełniających kryteria ARA z 1987 roku • aktywna postać choroby: OB > 30 mm/h i/lub CRP > 1,5 mg/dl, minimum 4 bolesne i 3 obrzęknięte stawy, DAS 28 > 3,2

13. Zasady dawkowania leków • MTX - doustnie w początkowej dawce 10-15 mg/tydz • Następnie do 8-12 tygodnia chorzy byli leczeni MTX w dawce 15 mg jeden raz w tygodniu • jeśli nie uzyskano, co najmniej umiarkowanej poprawy i jednocześnie nie było istotnych działań niepożądanych dawkę zwiększano do maksymalnie 25 mg, nie szybciej jednak niż o 5 mg co 2 tygodnie.

14. Ocena kliniczna i laboratoryjna • Kontrole 0, 2, 4, 6 miesiącu • Ocena kliniczna • liczba bolesnych i obrzękniętych stawów • oceny nasilenia bólu dokonywanej przez chorego (VAS) • oceny aktywności choroby wg chorego i lekarza • DAS28 • ogólna ocena sprawności fizycznej chorego • Kwestionariusz Oceny Stanu Zdrowia - HAQ) • badania laboratoryjne (OB, CRP) • ocena występowania działań niepożądanych.

15. MTHFR - reduktaza metylenotetrahydrofolianowa 1298 A/C-elektroforetyczny obraz produktów otrzymanych w wyniku reakcji PCR-RELPHomozygota typu dzikiego 1298 AA (produkt: 56bp); heterozygota 1298AC (produkty: 84bp i 56bp); homozygota typu 1298CC (produkt: 84bp).

16. Syntetaza tymidylowa (2R/3R) - elektroforetyczny obraz produktów otrzymanych w wyniku reakcji PCR-RELP Homozygota typu dzikiego- allel zawierający 2 powtórzenia 2R ; heterozygota 2R/3R powtórzenia; homozygota allel zawierający 3 powtórzenia 3R

20. Wyniki – wpływ polimorfizmów na skuteczność • Bez IS różnic: MTHFR C677T i A1298C, RFC-1 A80G, TYMS 2R/3R i 6bp ins/del, GGH C401T, TC P259R i TC I219L i TC L376S • Genotyp MTHFR 677CC - 1,8 x > skuteczność (p=0,051) • > skuteczność gdy kombinacja genotypów MTHFR 677 CC +RFC 80AA +MTHFR 1298AA (18/100%:163 /74%) p=0,039 • Homozygoty MTHFR 677CC - szybsza dobra odpowiedź na leczenie MTX (OR=3,4; p=0,001)

21. Polimorfizmy w których stwierdzono istotne statystycznie różnice w częstości występowanie wszystkich działań niepożądanych OR=3,7 OR=2,0 OR=2,0

22. Polimorfizmy związane z istotnie statystycznymi różnicami w częstości występowanie wzrostu aktywności aminotransferaz OR=3,4 OR=3,6

24. wywiad badanie fizykalne rozpoznanie badania genetyczne ocena aktywności badania laboratoryjne i obrazowe

25. „Dla każdego coś dobrego” U.S. News and World Report, January 24, 2003

26. Czy to tylko marzenia? • Możliwość identyfikacji polimorfizmu genów odpowiedzialnych za metabolizm leków • Różnice w genach u poszczególnych osób dotyczące klirensu leku i skutecznej dawki • Potrzebna kropla krwi • Czas oczekiwania 8 godzin Amplichip CYP450 Array

27. „Gdyby nie było różnic między ludźmi medycyna byłaby tylko nauką, a nie sztuką” Sir William Osler (1849-1919) Różnice w „odpowiedzi” na leki

29. CZY badania te są opłacalne?

31. v

32. RFC1-zredukowany nośnik folianów ; FPGS-syntetazafolylpoliglutaminianowa; TS- syntetaza tymidylowa ; DHFR-reduktazadihydrofolianów; 5,10 MTHFR, -reduktaza metyleno-tetrahydrofolianowaAICAR - transformylaza 5-aminoimidazol0-4-karboxamido-rybonukleotydowaJA Wessels. Rheumatology 2008;47:249–255

34. MTHFR C677T. Wzór prążków badanego polimorfizmu uzyskanego metodą PCR-RFLP.linia 8. homozygota typu 677TT (175bp) linia 9. homozygota typu dzikiego (198bp), linia 10. heterozygota (obecność dwóch produktów175bp +198bp)

36. Jakie marzenia na przyszłość • Testy SNP będą wystandaryzowane dla populacji pacjentów • Wyniki testu będą dostępne w codziennej praktyce i umożliwi to indywidualizację terapii • Zmapowanie SNP całego genomu będzie miało istotne znaczenie w doświadczeniach nad nowymi lekami

38. Polimorfizm pojedynczego nukleotydu • analizy SNP może pomóc w prognozowaniu występowania i w określeniu obrazu klinicznego takich chorób jak astma, cukrzyca, migrena, choroby serca, rzs. • Choroby te dziedziczy się wieloczynnikowo, a ich występowanie w dużym stopniu jest uzależnione od czynników środowiskowych. • W przyszłości wynik analizy SNP stanie się prawdopodobnie również podstawą tworzenia genetycznych „wizytówek” człowieka.

42. 1. Blokery TNF alfa – polimorfizm TNF-308 A/G • 1055 chorych na RZS • 455 – etanercept, 450 - infliksimab • Czas badania – 6 msc. • Ocena skuteczności – DAS28 , HAQ • TNF 308AA – gorsza odpowiedź na etanetcept (n=6; p=0,007), ale nie na infliksimab (n=17) • TNF 238 GA – gorsza odpowiedź na infliksimab (n=40; p=0,028) ale nie na etanercept (n=33) • Maxwell JR. Hum Mol Genet. 2008 Nov 15;17(22):3532-8.

43. Cechy idealnego leku • Lek który działa • Lek który jest bezpieczny • Dawki które są właściwe dla konkretnego chorego

45. 3. Blokery TNF alfa – polimorfizm TNF-308 A/G • 81 chorych na RZS • Adalimumab 24 tygodnie • Ocena skuteczności terapii: - DAS28 • 88% z 308GG i 68% z 308 GA dobrze odpowiadało na leczenie adalimumabem (p=0,05)

46. Tworzenia nowych standardów bezpieczeństwa i skuteczności terapii • Prowadzenie badań klinicznych ze znanymi fenotypowo pacjentami dla określenia polimorfizmów SNP odpowiedzialnych za skuteczność terapii • Prowadzenie obserwacji post-marketingowych dla zidentyfikowania profilu SNP charakterystycznego dla działań niepożądanych

47. Informacje podstawowe, definicje • Gen – czynnik genetyczny zawierający pojedynczą jednostkę dziedziczenia. • Oznacza odcinek DNA kodujący syntezę pojedynczego łańcucha polipeptydowego • Allel – jedna z kilku alternatywnych form genu leżącego w danym locus • Locus genu – pozycja zajmowana przez gen w chromosomie

48. 4. Blokery TNF alfa – polimorfizm TNF-308 A/G • 388 chorych z Francji uczestniczących w badaniu ReAct(adalimumab lub adalimumab + MTX lub adalimumab + inny LMPCH) • 12 tygodni • 40% chorych uzyskało minimum poprawę ACR50% • Pojedynczo TNF 238A/G, 308A/G, 857 C/T nie miały wpływu na skuteczność i działania niepożądane • TNF 238G+308G+857C - to mniejszy odsetek dobrze odpowiadających (34/50%) • Miceli-Richard C. Ann Rheum Dis. 2008 Apr;67(4):478-84.

49. Polimorfizm pojedynczego nukleotydu • Najczęściej jest spotykany polimorfizm dwualleliczny rzadziej trójalleliczny • SNP występujące w genach i obszarach regulatorowych decydują o indywidualnej charakterystyce danego osobnika • Gęstość i nasycenie SNP nie są jednak identyczne dla całego genomu. • największe zagęszczenie jest locus HLA na chromosomie 6. • na chromosomie X zidentyfikowano „pustynie SNP”.

50. Indywidualizacja terapii • Pojedynczy SNP jest obecny w 5% całej populacji, ale w 95% chorych z działaniami niepożądanymi • Częstość działań niepożądanych min. 5% • SNP test może zmniejszyć częstość działań niepożądanych do 0.25% • Korzyści • zwiększenie bezpieczeństwa, • zmniejszenie konieczności wykonywania badań kontrolnych, • zwiększenie skuteczności terapii