Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei

1. Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei Nagy Gábor DEOEC III. Belgyógyászati Klinika Regionális Immunológiai Laboratórium ODLA III. évfolyam Immunológiai diagnosztikai módszerek 2010. március 16.

2. Diagnosztikai algoritmus

3. Első vizsgálatok:vérkép • metodika: • optikai elv • impedancia elv • paraméterek: • össz fehérvérsejt szám • absz. limfocita szám • absz. granulocita szám • thrombocita szám és méret (MPV)

4. Első vizsgálatok:össz IgG, IgA, IgM Turbidimetria A fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri Nefelometria A szórt fény intenzitását méri

5. Immunglobulin szintek életkor függése IgG Immunglobulinok mennyisége IgA IgM

6. Immunglobulin szintek: össz IgE • Több nagyságrenddel alacsonyabb koncentráció • ELISA (indirekt jelölésű) • kU/l • hiper IgE-sy

7. Össz Ig szintek változása immundeficienciákban • hipogammaglobulinémia esetén ki kell zárni a veszést (pl. nephrosis sy) • Szelektív IgA hiány: • se és nyál IgA mérhetetlenül alacsony • Hiper IgM: IgM, IgA, IgG • Hiper IgE: IgE  (>2000 kU/l) • congenitális agammaglobulinémia: IgG, A, M   • CVID: Ig  (>=két Ig osztályban) • ALPS: Ig 

8. Szűrő jellegű vizsgálatok

9. Humorális immunrendszer:IgG alosztályok • G1, G2, G3, G4 alosztályok • metodika: nefelometria • az össz IgG ált normális tartományban van (kivéve, ha IgG1 hiányzik) • izolált alosztály deficiencia • szelektív IgA hiány mellett gyakran

10. Izohemagglutinin • az A és B vércsoport ellenes, alacsony affinitású IgM típusú At-ek, melyek a vércsoport-szabálynak megfelelően fiziológiásan megjelennek, valószínűleg bakteriális Ag-ek keresztrekaciója miatt • hiányuk B-sejt defektusra utal • módszer: hemagglutináció • hiányzik: pl. CVID

11. Fehérje és poliszacharid specifikus antitestek • Fehérje antigénre adott immunválasz • Diphtheria toxin e. antitest • Tetanus toxin e. antitest • Poliszacharid antigénre adott immunválasz • H. influenzae e. antitest • Pneumococcus e. antitestek • Meningococcus e. antitestek • módszer: ELISA

12. Fehérje és PS specifikus antitestek csökkent válasz: CVID

13. Sejtes immunrendszer vizsgálatai:Absz. limfocita szám • Absz. limfocita szám • életkorfüggő referencia tartomány • elsősorban a T-sejtszámot tükrözi • limfopénia: • SCID (gamma-lánc, ADA, PNP, reticuláris dysgenesis) • cong. agammaglobulinémia • csökken lehet: CVID

14. Bőrtesztek • T-sejt funkció jó szűrőtesztje • vírus és gomba fertőzések • antigén: • Tuberkulin-bőrteszt • Tetanus-bőrteszt • Diphteria-bőrteszt • Candida-bőrteszt • elve: késői típusú hiperszenz. • in vitro: limfocita proliferációs tesztek

15. Áramlási citometria

16. Áramlási citometria • T limfocita markerek: CD3, CD2, CD7 • B limfocita markerek: CD19, CD20, CD21 • Helper T limfocita marker: CD4 • Citotoxikus T limfocita marker: CD8 • NK sejt markerek: CD56, CD16 • T sejt aktivációs markerek: CD69, CD25, HLA-DR • Neutrofil granulocita markerek: CD16, CD32 • Monocita markerek: CD13, CD14 • Makrofág markerek: CD36, CD68, CD71

17. Áramlási citometria • limfocita szubpopuláció: • T: CD3+ • Th: CD4+ • Tc: CD8+ • B: CD19+ • NK: CD16+, CD56+

18. Áramlási citometria

19. Áramlási citometria • CD40, CD40L, sIgA/G/D (hiperIgM) • MHC I-II (MHC deficienciák) • CD4-/CD8- T-sejt : ALPS • Treg  (CD4+,CD25bright,FOXP3+): • Immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy X-linked (IPEX)

20. ADA, PNP enzimaktivitás • purin anyagcsere enzimei • Adenozin dezamináz: • adenozin-inozin átalakítás • Purin nukleozid foszforiláz: • guanozin-guanin • inozin-hipoxantin átalakítás • Súlyos kombinált ID • ADA: T és B • PNP: elsősorban T (valószínűleg a T sejtek magas dGTP tartalma miatt)

21. ADA, PNP enzimaktivitás • eritrociták enzimaktivitását határozzuk meg • vvt-ket 3x mossuk • beállítjuk a hgb-t • lizáljuk a vvt-ket • megfelelő szubszrátot adunk a rendszerhez • adenozin (ADA) • inozin (PNP) • a keletkező végterméket UV spektrofotometriával mérjük • az enzimaktivitást hgb-ra normálva adjuk meg

22. ADA, PNP enzimaktivitás • az enzimaktivitás: • homozigóta formában mérhetetlenül alacsony • heterozigóta formában kb. az kontrollok fele • parciális ADA deficiencia: • vvt-ben nem mérhető aktivitás, de más szövetekben van (instabil enzim)

23. Kostmann sy ciklikus neutropénia Chediak-Higashi sy reticularis dysgenesis WHIM sy (Wart, Hypogammaglobulinemia, Infection, and Myelokathexis syndrome) kemoth. gyógyszerek immun nonimmun autoimmun alloimmun hiányállapotok (B2, folsav, réz) AIDS Fagocita rendszer vizsgálatai:abszolút neutrofil szám

24. Fagocita sejtek vizsgálata:granulocita ellenes at. • a mérés elve lehet: • áramlási citometria • sejtes ELISA

25. Fagocita sejtek vizsgálata:funkcionális vizsgálatok • adherencia • granulocita szám mérés • üveggyönggyel inkubáció • granulocita szám mérés • adhezív proteinek (áramlási citometria): • LAD1: CD11a,b,c/CD18 • LAD2: CD15 • kemotaxis • Boyden-kamra

26. Fagocita sejtek vizsgálata:funkcionális vizsgálatok • fagocitózis • mikroszkóp: particulumok (élesztőgomba) • FC: FITC-cel jelölt immunglobulinnal preopszonizált E. coli • telepszámlálás: be nem kebelezett baktérium visszamérése • intracelluláris killing • telepszámlálás: bekebelezés után életben maradt baktériumok visszamérése

27. Fagocita sejtek vizsgálata:funkcionális vizsgálatok • oxidatív burst • NBT (nitroblue-tetrasolium) redukció • sárga NBT->kék/fekete formazán • mikroszkópos kiértékelés • DHR (dihidro-rodamin) oxidáció • DHR->rodamin (fluoreszkál) • teljes vér kemilumineszcencia • H2O2 + luminol -> 3-aminoftalát* -> 3-aminoftalát + foton • szuperoxid anion termelés • ferricitokróm-C szuperoxid-dizmutázzal gátolható redukciója (fotometriás kiértékelés) • csökkent: CGD

28. Fagocita sejtek vizsgálata: enzimdefektusok • MPO • primer, azurofil granulumban található enzim • H2O2->HOCl • deficienciája gyakori: 1:2000 • benzidin-hidrokloridot oxidálja->kék szín

29. Fagocita sejtek vizsgálata:mikroszkópos morfológia • Chediak-Higashi sy • kóros a fagolizoszóma formálás

30. Komplement rendszer:deficienciák

31. Komplement rendszer:össz komplement aktivitás • klasszikus út: CH50 • szenzitizált birka vvt. • alternatív út: AH50 • nyúl vvt.

32. Komplement rendszer:CH50 meghatározás 50x 100x 200x 400x Vak Spontán lísis kontroll Teljes lízis kontroll Beteg1 Beteg2 Betegx hemolízis%= (ODminta-OD(SPLK))/OD(TLK)

33. Komplement rendszer:CH50 meghatározás logx=logK+1/n*log(y/(1-y)) x=szérum térfogat y=hemolízis% CH50=annak a szérumtérfogatnak a reciproka, ami 50%-os lízist okoz

34. Komplement rendszer:értékelés

35. Komplement rendszer:egyes faktorok • antigén meghatározás: • radiális immundiffúzió • rakétaelektroforézis • nefelometria • ELISA • funkciónális meghatározás: • hemolitikus assay (a mérendő faktor kivételével a faktorok feleslegben) • klasszikus út komponensei: szenzitizált birka vvt. • alternatív út komponensei: nyúl v. tengerimalac vvt.