Az immundeficienci k kimutat s nak laborat riumi m dszerei
Sponsored Links
This presentation is the property of its rightful owner.
1 / 35

Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei PowerPoint PPT Presentation


  • 96 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei. Nagy Gábor DEOEC III. Belgyógyászati Klinika Regionális Immunológiai Laboratórium ODLA III. évfolyam Immunológiai diagnosztikai módszerek 2010. március 16. Diagnosztikai algoritmus. Első vizsgálatok: vérkép. metodika:

Download Presentation

Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei

Nagy Gábor

DEOEC III. Belgyógyászati Klinika

Regionális Immunológiai Laboratórium

ODLA III. évfolyam

Immunológiai diagnosztikai módszerek

2010. március 16.


Diagnosztikai algoritmus


Első vizsgálatok:vérkép

  • metodika:

    • optikai elv

    • impedancia elv

  • paraméterek:

    • össz fehérvérsejt szám

    • absz. limfocita szám

    • absz. granulocita szám

    • thrombocita szám és méret (MPV)


Első vizsgálatok:össz IgG, IgA, IgM

Turbidimetria

A fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri

Nefelometria

A szórt fény intenzitását méri


Immunglobulin szintek életkor függése

IgG

Immunglobulinok mennyisége

IgA

IgM


Immunglobulin szintek: össz IgE

  • Több nagyságrenddel alacsonyabb koncentráció

  • ELISA (indirekt jelölésű)

  • kU/l

  • hiper IgE-sy


Össz Ig szintek változása immundeficienciákban

  • hipogammaglobulinémia esetén ki kell zárni a veszést (pl. nephrosis sy)

  • Szelektív IgA hiány:

    • se és nyál IgA mérhetetlenül alacsony

  • Hiper IgM: IgM, IgA, IgG

  • Hiper IgE: IgE  (>2000 kU/l)

  • congenitális agammaglobulinémia: IgG, A, M  

  • CVID: Ig  (>=két Ig osztályban)

  • ALPS: Ig 


Szűrő jellegű vizsgálatok


Humorális immunrendszer:IgG alosztályok

  • G1, G2, G3, G4 alosztályok

  • metodika: nefelometria

  • az össz IgG ált normális tartományban van (kivéve, ha IgG1 hiányzik)

  • izolált alosztály deficiencia

  • szelektív IgA hiány mellett gyakran


Izohemagglutinin

  • az A és B vércsoport ellenes, alacsony affinitású IgM típusú At-ek, melyek a vércsoport-szabálynak megfelelően fiziológiásan megjelennek, valószínűleg bakteriális Ag-ek keresztrekaciója miatt

  • hiányuk B-sejt defektusra utal

  • módszer: hemagglutináció

  • hiányzik: pl. CVID


Fehérje és poliszacharid specifikus antitestek

  • Fehérje antigénre adott immunválasz

    • Diphtheria toxin e. antitest

    • Tetanus toxin e. antitest

  • Poliszacharid antigénre adott immunválasz

    • H. influenzae e. antitest

    • Pneumococcus e. antitestek

    • Meningococcus e. antitestek

  • módszer: ELISA


Fehérje és PS specifikus antitestek

csökkent válasz: CVID


Sejtes immunrendszer vizsgálatai:Absz. limfocita szám

  • Absz. limfocita szám

    • életkorfüggő referencia tartomány

    • elsősorban a T-sejtszámot tükrözi

    • limfopénia:

      • SCID (gamma-lánc, ADA, PNP, reticuláris dysgenesis)

      • cong. agammaglobulinémia

    • csökken lehet: CVID


Bőrtesztek

  • T-sejt funkció jó szűrőtesztje

  • vírus és gomba fertőzések

  • antigén:

    • Tuberkulin-bőrteszt

    • Tetanus-bőrteszt

    • Diphteria-bőrteszt

    • Candida-bőrteszt

  • elve: késői típusú hiperszenz.

  • in vitro: limfocita proliferációs tesztek


Áramlási citometria


Áramlási citometria

  • T limfocita markerek:CD3, CD2, CD7

  • B limfocita markerek: CD19, CD20, CD21

  • Helper T limfocita marker:CD4

  • Citotoxikus T limfocita marker:CD8

  • NK sejt markerek:CD56, CD16

  • T sejt aktivációs markerek:CD69, CD25, HLA-DR

  • Neutrofil granulocita markerek:CD16, CD32

  • Monocita markerek:CD13, CD14

  • Makrofág markerek:CD36, CD68, CD71


Áramlási citometria

  • limfocita szubpopuláció:

    • T: CD3+

      • Th: CD4+

      • Tc: CD8+

    • B: CD19+

    • NK: CD16+, CD56+


Áramlási citometria


Áramlási citometria

  • CD40, CD40L, sIgA/G/D (hiperIgM)

  • MHC I-II (MHC deficienciák)

  • CD4-/CD8- T-sejt : ALPS

  • Treg  (CD4+,CD25bright,FOXP3+):

    • Immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy X-linked (IPEX)


ADA, PNP enzimaktivitás

  • purin anyagcsere enzimei

    • Adenozin dezamináz:

      • adenozin-inozin átalakítás

    • Purin nukleozid foszforiláz:

      • guanozin-guanin

      • inozin-hipoxantin átalakítás

  • Súlyos kombinált ID

    • ADA: T és B

    • PNP: elsősorban T (valószínűleg a T sejtek magas dGTP tartalma miatt)


ADA, PNP enzimaktivitás

  • eritrociták enzimaktivitását határozzuk meg

  • vvt-ket 3x mossuk

  • beállítjuk a hgb-t

  • lizáljuk a vvt-ket

  • megfelelő szubszrátot adunk a rendszerhez

    • adenozin (ADA)

    • inozin (PNP)

  • a keletkező végterméket UV spektrofotometriával mérjük

  • az enzimaktivitást hgb-ra normálva adjuk meg


ADA, PNP enzimaktivitás

  • az enzimaktivitás:

    • homozigóta formában mérhetetlenül alacsony

    • heterozigóta formában kb. az kontrollok fele

  • parciális ADA deficiencia:

    • vvt-ben nem mérhető aktivitás, de más szövetekben van (instabil enzim)


Kostmann sy

ciklikus neutropénia

Chediak-Higashi sy

reticularis dysgenesis

WHIM sy (Wart, Hypogammaglobulinemia, Infection, and Myelokathexis syndrome)

kemoth.

gyógyszerek

immun

nonimmun

autoimmun

alloimmun

hiányállapotok (B2, folsav, réz)

AIDS

Fagocita rendszer vizsgálatai:abszolút neutrofil szám


Fagocita sejtek vizsgálata:granulocita ellenes at.

  • a mérés elve lehet:

    • áramlási citometria

    • sejtes ELISA


Fagocita sejtek vizsgálata:funkcionális vizsgálatok

  • adherencia

    • granulocita szám mérés

    • üveggyönggyel inkubáció

    • granulocita szám mérés

  • adhezív proteinek (áramlási citometria):

    • LAD1: CD11a,b,c/CD18

    • LAD2: CD15

  • kemotaxis

    • Boyden-kamra


Fagocita sejtek vizsgálata:funkcionális vizsgálatok

  • fagocitózis

    • mikroszkóp: particulumok (élesztőgomba)

    • FC: FITC-cel jelölt immunglobulinnal preopszonizált E. coli

    • telepszámlálás: be nem kebelezett baktérium visszamérése

  • intracelluláris killing

    • telepszámlálás: bekebelezés után életben maradt baktériumok visszamérése


Fagocita sejtek vizsgálata:funkcionális vizsgálatok

  • oxidatív burst

    • NBT (nitroblue-tetrasolium) redukció

      • sárga NBT->kék/fekete formazán

      • mikroszkópos kiértékelés

    • DHR (dihidro-rodamin) oxidáció

      • DHR->rodamin (fluoreszkál)

    • teljes vér kemilumineszcencia

      • H2O2 + luminol -> 3-aminoftalát* -> 3-aminoftalát + foton

    • szuperoxid anion termelés

      • ferricitokróm-C szuperoxid-dizmutázzal gátolható redukciója (fotometriás kiértékelés)

  • csökkent: CGD


Fagocita sejtek vizsgálata: enzimdefektusok

  • MPO

    • primer, azurofil granulumban található enzim

    • H2O2->HOCl

    • deficienciája gyakori: 1:2000

    • benzidin-hidrokloridot oxidálja->kék szín


Fagocita sejtek vizsgálata:mikroszkópos morfológia

  • Chediak-Higashi sy

  • kóros a fagolizoszóma formálás


Komplement rendszer:deficienciák


Komplement rendszer:össz komplement aktivitás

  • klasszikus út: CH50

    • szenzitizált birka vvt.

  • alternatív út: AH50

    • nyúl vvt.


Komplement rendszer:CH50 meghatározás

50x 100x 200x 400x

Vak

Spontán lísis kontroll

Teljes lízis kontroll

Beteg1

Beteg2

Betegx

hemolízis%=

(ODminta-OD(SPLK))/OD(TLK)


Komplement rendszer:CH50 meghatározás

logx=logK+1/n*log(y/(1-y))

x=szérum térfogat

y=hemolízis%

CH50=annak a szérumtérfogatnak a reciproka, ami 50%-os lízist okoz


Komplement rendszer:értékelés


Komplement rendszer:egyes faktorok

  • antigén meghatározás:

    • radiális immundiffúzió

    • rakétaelektroforézis

    • nefelometria

    • ELISA

  • funkciónális meghatározás:

    • hemolitikus assay (a mérendő faktor kivételével a faktorok feleslegben)

    • klasszikus út komponensei: szenzitizált birka vvt.

    • alternatív út komponensei: nyúl v. tengerimalac vvt.


  • Login