Az immundeficienci k kimutat s nak laborat riumi m dszerei
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 35

Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei PowerPoint PPT Presentation


  • 83 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei. Nagy Gábor DEOEC III. Belgyógyászati Klinika Regionális Immunológiai Laboratórium ODLA III. évfolyam Immunológiai diagnosztikai módszerek 2010. március 16. Diagnosztikai algoritmus. Első vizsgálatok: vérkép. metodika:

Download Presentation

Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Az immundeficienci k kimutat s nak laborat riumi m dszerei

Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei

Nagy Gábor

DEOEC III. Belgyógyászati Klinika

Regionális Immunológiai Laboratórium

ODLA III. évfolyam

Immunológiai diagnosztikai módszerek

2010. március 16.


Diagnosztikai algoritmus

Diagnosztikai algoritmus


Els vizsg latok v rk p

Első vizsgálatok:vérkép

  • metodika:

    • optikai elv

    • impedancia elv

  • paraméterek:

    • össz fehérvérsejt szám

    • absz. limfocita szám

    • absz. granulocita szám

    • thrombocita szám és méret (MPV)


Els vizsg latok ssz igg iga igm

Első vizsgálatok:össz IgG, IgA, IgM

Turbidimetria

A fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri

Nefelometria

A szórt fény intenzitását méri


Immunglobulin szintek letkor f gg se

Immunglobulin szintek életkor függése

IgG

Immunglobulinok mennyisége

IgA

IgM


Immunglobulin szintek ssz ige

Immunglobulin szintek: össz IgE

  • Több nagyságrenddel alacsonyabb koncentráció

  • ELISA (indirekt jelölésű)

  • kU/l

  • hiper IgE-sy


Ssz ig szintek v ltoz sa immundeficienci kban

Össz Ig szintek változása immundeficienciákban

  • hipogammaglobulinémia esetén ki kell zárni a veszést (pl. nephrosis sy)

  • Szelektív IgA hiány:

    • se és nyál IgA mérhetetlenül alacsony

  • Hiper IgM: IgM, IgA, IgG

  • Hiper IgE: IgE  (>2000 kU/l)

  • congenitális agammaglobulinémia: IgG, A, M  

  • CVID: Ig  (>=két Ig osztályban)

  • ALPS: Ig 


Sz r jelleg vizsg latok

Szűrő jellegű vizsgálatok


Humor lis immunrendszer igg aloszt lyok

Humorális immunrendszer:IgG alosztályok

  • G1, G2, G3, G4 alosztályok

  • metodika: nefelometria

  • az össz IgG ált normális tartományban van (kivéve, ha IgG1 hiányzik)

  • izolált alosztály deficiencia

  • szelektív IgA hiány mellett gyakran


Izohemagglutinin

Izohemagglutinin

  • az A és B vércsoport ellenes, alacsony affinitású IgM típusú At-ek, melyek a vércsoport-szabálynak megfelelően fiziológiásan megjelennek, valószínűleg bakteriális Ag-ek keresztrekaciója miatt

  • hiányuk B-sejt defektusra utal

  • módszer: hemagglutináció

  • hiányzik: pl. CVID


Feh rje s poliszacharid specifikus antitestek

Fehérje és poliszacharid specifikus antitestek

  • Fehérje antigénre adott immunválasz

    • Diphtheria toxin e. antitest

    • Tetanus toxin e. antitest

  • Poliszacharid antigénre adott immunválasz

    • H. influenzae e. antitest

    • Pneumococcus e. antitestek

    • Meningococcus e. antitestek

  • módszer: ELISA


Feh rje s ps specifikus antitestek

Fehérje és PS specifikus antitestek

csökkent válasz: CVID


Sejtes immunrendszer vizsg latai absz limfocita sz m

Sejtes immunrendszer vizsgálatai:Absz. limfocita szám

  • Absz. limfocita szám

    • életkorfüggő referencia tartomány

    • elsősorban a T-sejtszámot tükrözi

    • limfopénia:

      • SCID (gamma-lánc, ADA, PNP, reticuláris dysgenesis)

      • cong. agammaglobulinémia

    • csökken lehet: CVID


B rtesztek

Bőrtesztek

  • T-sejt funkció jó szűrőtesztje

  • vírus és gomba fertőzések

  • antigén:

    • Tuberkulin-bőrteszt

    • Tetanus-bőrteszt

    • Diphteria-bőrteszt

    • Candida-bőrteszt

  • elve: késői típusú hiperszenz.

  • in vitro: limfocita proliferációs tesztek


Raml si citometria

Áramlási citometria


Raml si citometria1

Áramlási citometria

  • T limfocita markerek:CD3, CD2, CD7

  • B limfocita markerek: CD19, CD20, CD21

  • Helper T limfocita marker:CD4

  • Citotoxikus T limfocita marker:CD8

  • NK sejt markerek:CD56, CD16

  • T sejt aktivációs markerek:CD69, CD25, HLA-DR

  • Neutrofil granulocita markerek:CD16, CD32

  • Monocita markerek:CD13, CD14

  • Makrofág markerek:CD36, CD68, CD71


Raml si citometria2

Áramlási citometria

  • limfocita szubpopuláció:

    • T: CD3+

      • Th: CD4+

      • Tc: CD8+

    • B: CD19+

    • NK: CD16+, CD56+


Raml si citometria3

Áramlási citometria


Raml si citometria4

Áramlási citometria

  • CD40, CD40L, sIgA/G/D (hiperIgM)

  • MHC I-II (MHC deficienciák)

  • CD4-/CD8- T-sejt : ALPS

  • Treg  (CD4+,CD25bright,FOXP3+):

    • Immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy X-linked (IPEX)


Ada pnp enzimaktivit s

ADA, PNP enzimaktivitás

  • purin anyagcsere enzimei

    • Adenozin dezamináz:

      • adenozin-inozin átalakítás

    • Purin nukleozid foszforiláz:

      • guanozin-guanin

      • inozin-hipoxantin átalakítás

  • Súlyos kombinált ID

    • ADA: T és B

    • PNP: elsősorban T (valószínűleg a T sejtek magas dGTP tartalma miatt)


Ada pnp enzimaktivit s1

ADA, PNP enzimaktivitás

  • eritrociták enzimaktivitását határozzuk meg

  • vvt-ket 3x mossuk

  • beállítjuk a hgb-t

  • lizáljuk a vvt-ket

  • megfelelő szubszrátot adunk a rendszerhez

    • adenozin (ADA)

    • inozin (PNP)

  • a keletkező végterméket UV spektrofotometriával mérjük

  • az enzimaktivitást hgb-ra normálva adjuk meg


Ada pnp enzimaktivit s2

ADA, PNP enzimaktivitás

  • az enzimaktivitás:

    • homozigóta formában mérhetetlenül alacsony

    • heterozigóta formában kb. az kontrollok fele

  • parciális ADA deficiencia:

    • vvt-ben nem mérhető aktivitás, de más szövetekben van (instabil enzim)


Fagocita rendszer vizsg latai abszol t neutrofil sz m

Kostmann sy

ciklikus neutropénia

Chediak-Higashi sy

reticularis dysgenesis

WHIM sy (Wart, Hypogammaglobulinemia, Infection, and Myelokathexis syndrome)

kemoth.

gyógyszerek

immun

nonimmun

autoimmun

alloimmun

hiányállapotok (B2, folsav, réz)

AIDS

Fagocita rendszer vizsgálatai:abszolút neutrofil szám


Fagocita sejtek vizsg lata granulocita ellenes at

Fagocita sejtek vizsgálata:granulocita ellenes at.

  • a mérés elve lehet:

    • áramlási citometria

    • sejtes ELISA


Fagocita sejtek vizsg lata funkcion lis vizsg latok

Fagocita sejtek vizsgálata:funkcionális vizsgálatok

  • adherencia

    • granulocita szám mérés

    • üveggyönggyel inkubáció

    • granulocita szám mérés

  • adhezív proteinek (áramlási citometria):

    • LAD1: CD11a,b,c/CD18

    • LAD2: CD15

  • kemotaxis

    • Boyden-kamra


Fagocita sejtek vizsg lata funkcion lis vizsg latok1

Fagocita sejtek vizsgálata:funkcionális vizsgálatok

  • fagocitózis

    • mikroszkóp: particulumok (élesztőgomba)

    • FC: FITC-cel jelölt immunglobulinnal preopszonizált E. coli

    • telepszámlálás: be nem kebelezett baktérium visszamérése

  • intracelluláris killing

    • telepszámlálás: bekebelezés után életben maradt baktériumok visszamérése


Fagocita sejtek vizsg lata funkcion lis vizsg latok2

Fagocita sejtek vizsgálata:funkcionális vizsgálatok

  • oxidatív burst

    • NBT (nitroblue-tetrasolium) redukció

      • sárga NBT->kék/fekete formazán

      • mikroszkópos kiértékelés

    • DHR (dihidro-rodamin) oxidáció

      • DHR->rodamin (fluoreszkál)

    • teljes vér kemilumineszcencia

      • H2O2 + luminol -> 3-aminoftalát* -> 3-aminoftalát + foton

    • szuperoxid anion termelés

      • ferricitokróm-C szuperoxid-dizmutázzal gátolható redukciója (fotometriás kiértékelés)

  • csökkent: CGD


Fagocita sejtek vizsg lata enzimdefektusok

Fagocita sejtek vizsgálata: enzimdefektusok

  • MPO

    • primer, azurofil granulumban található enzim

    • H2O2->HOCl

    • deficienciája gyakori: 1:2000

    • benzidin-hidrokloridot oxidálja->kék szín


Fagocita sejtek vizsg lata mikroszk pos morfol gia

Fagocita sejtek vizsgálata:mikroszkópos morfológia

  • Chediak-Higashi sy

  • kóros a fagolizoszóma formálás


Komplement rendszer deficienci k

Komplement rendszer:deficienciák


Komplement rendszer ssz komplement aktivit s

Komplement rendszer:össz komplement aktivitás

  • klasszikus út: CH50

    • szenzitizált birka vvt.

  • alternatív út: AH50

    • nyúl vvt.


Komplement rendszer ch50 meghat roz s

Komplement rendszer:CH50 meghatározás

50x 100x 200x 400x

Vak

Spontán lísis kontroll

Teljes lízis kontroll

Beteg1

Beteg2

Betegx

hemolízis%=

(ODminta-OD(SPLK))/OD(TLK)


Komplement rendszer ch50 meghat roz s1

Komplement rendszer:CH50 meghatározás

logx=logK+1/n*log(y/(1-y))

x=szérum térfogat

y=hemolízis%

CH50=annak a szérumtérfogatnak a reciproka, ami 50%-os lízist okoz


Komplement rendszer rt kel s

Komplement rendszer:értékelés


Komplement rendszer egyes faktorok

Komplement rendszer:egyes faktorok

  • antigén meghatározás:

    • radiális immundiffúzió

    • rakétaelektroforézis

    • nefelometria

    • ELISA

  • funkciónális meghatározás:

    • hemolitikus assay (a mérendő faktor kivételével a faktorok feleslegben)

    • klasszikus út komponensei: szenzitizált birka vvt.

    • alternatív út komponensei: nyúl v. tengerimalac vvt.


  • Login