MOVIMENTO DI IONI IN UN CAMPO ELETTRICO

1. ELETTROFORESI MOVIMENTO DI IONI IN UN CAMPO ELETTRICO Processo di elettrolisi al catodo e all’anodo al catodo: 2e-+ 2H2O 2OH- + H2 all'anodo: H2O 2H+ + ½ O2­ + 2e-

2. Acidi nucleici Aminoacidi Proteine Peptidi Nucleotidi PRINCIPI DI ELETTROFORESI Biomolecole cariche: possiedono gruppi ionizzabili, in soluzione sia come cationi sia come anioni, e possono essere separate tra loro per la diversa carica, applicando un campo elettrico. Alimentatore – Cella elettroforetica La velocità di migrazione dipende dal rapporto tra forza di spinta del campo elettrico e le forze frenanti esistenti tra ioni e mezzo circostante. Carica: q; Campo elettrico: E, in V (volt)/d; dove: V= diff. potenziale tra i due elettrodi e d= distanza tra i due elettrodi; Resistenza di attrito : f (forze frizionali) = 6pr, dimensioni molecola e resistenza del mezzo. Mobilità relativa qE/f, proporzionale alla carica e al campo, inv. proporzionale alle forze d’attrito –densità di carica (carica/massa).

3. L’elettroforesi viene solitamente condotta : utilizzando un supporto solido: di larga applicazione sia per separare acidi nucleici che proteine esiste anche elettroforesi in fase liquida Elettroforesi in supporto solido: il campione viene sciolto in un opportuno tampone così come il supporto viene immerso in tampone a opportuno pH e forza ionica per saturarlo e consentire la conduzione della corrente. Le componenti migrano come bande nette ben visualizzabili mediante varie strategie di colorazione al termine della corsa elettroforetica. Caratteristiche del supporto: stabile, inerte, omogeneo. Supporti non setaccianti o setaccianti - “setaccio” controllabile o a porosità definita. TIPI DI SUPPORTO: - Carta da filtro - acetato di cellulosa non setacciante – proteine del siero (diagnostica) - gel di agarosio - setacciante - gel di poliacrilammide - setacciante

4. Fattori che influenzano la migrazione: carica e dimensioni (carica/massa), forma delle molecole del campione Tipo di supporto Forza ionica e pH: tampone Temperatura Forza ionica: aumentando la forza ionica del tampone aumenta la f.e.m. della cella, ma se f.i. è troppo elevata non favorisce la migrazione delle molecole da separare perché aumenta la competizione tra ioni del campione e ioni del tampone. Una forza ionica troppo bassa, viceversa, favorisce fenomeni di diffusione e non consente una buona risoluzione finale. Il pHha un ovvio ruolo condizionando il grado di ionizzazione sia degli ioni da separare (del campione) che degli ioni trainanti del tampone (acidi deboli). Temperatura: fattore molto importante - diminuisce la viscosità del mezzo e diminuisce le forze di attrito e la resistenza- d’altra parte un aumento eccessivo di temperatura può sia alterare il supporto sia concentrare il tampone riducendo la migrazione. Resistenza durante la corsa elettroforetica comporta aumento di T; T=k, 20-22°C – termostati, condizionatori (alti voltaggi)- celle isolate- corrente costante. Supporto: per uno studio fine sono preferibili i supporti setaccianti e a porosità controllabile. Tecnica elettiva : PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide) Studio delle proteine: Condizioni NATIVE SDS-PAGE (denaturanti)

5. PREPARAZIONE DEI GEL DI POLIACRILAMMIDE Gel di poliacrilammide: e’ un polimero formato da monomeri di acrilammide. L’acrilamide prima della polimerizzazioneè liquida ed è, in tale stato, neurotossica e cancerogena. Il polimero solido non è più tossico per l’operatore. Si utilizza per separare proteine grazie alla sua porosità controllabile: pori del gel più o meno stretti in base alla concentrazione % di acrilammide di partenza. Può essere utilizzata sia per l’elettroforesi di proteine in condizioni native che denaturanti. Separa proteine con PM da 5000 a 200.000 Da. Vantaggi dell’uso della poliacrilammide: - Resistenza meccanica, trasparenza nell’ UV e visibile, alta aderenza al vetro - I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell’uso: si fa polimerizzare l’acrilammide insieme al derivato metilen-bis-acrilammide. Si prepara una soluzione stock di acrilammide e bis- acrilammide (o dal commercio) e si diluisce opportunamente nel tampone assieme agli agenti di polimerizazzione: il TEMED (N-tetrametilendiammina), iniziatore e stabilizzatore di radicali liberi, e l’APS, ammonio persolfato, catalizzatore della reazione radicalica. APS in presenza di TEMED dà origine ad una specie radicalica -radicale libero dal persolfato: S2O82- + 1e-SO42- + SO4-. Polimerizzazione radicalica inibita da O2

6. % acrilammide

7. ELETTROFORESI PAGE IN CONDIZIONI NATIVE Le proteine vengono separate sia in base alla carica propria e quindi in base alla diversa sequenza di AA sia in base alle diverse dimensioni e forma. I gel in condizioni native hanno un potere risolutivo relativamente minore pI delle proteine – tamponi a pH 8-9.5 proteine basiche si separano a pH acido • I gel in condizioni native hanno i seguenti vantaggi: • discriminano tra proteine con PM uguale e diversa carica • consentono il recupero e la rapida purificazione di proteine nella loro forma nativa • consentono di separare proteine e enzimi nella loro forma attiva • consentono colorazioni molto specifiche di tipo catalitico • Si possono studiare proteine polimeriche, senza separare le subunità polipeptidiche.

8. ELETTROFORESI SDS-PAGE IN CONDIZIONI DENATURANTI Sia il gel di poliacrilammide, il campione che deve essere sottoposto ad elettroforesi che il tampone di corsa, vengono preparati aggiungendo un detergente anionico il sodio dodecilsolfato SDS In presenza di SDS la struttura terziaria delle proteine viene destabilizzata, le proteine si denaturano, assumono una forma a bastoncino, linearizzata e la carica netta della forma nativa viene resa trascurabile dalla carica dell’SDS, mentre tutte diventano cariche negativamente. Forma simile e carica/massa simile: cariche dirett. prop. a massa. Separazione solo per PM diverso. Nel “setaccio” del gel: le proteine più grosse migreranno meno; le più piccole migreranno più velocemente. SDS separa anche subunità non associate covalentemente. b-mercaptoetanolo: rompe i ponti disolfuro Bollitura: per campioni biologici

9. I gel di poliacrilammide SDS-PAGE e nativi sono gel preparati verticalmente: gel verticali. L’elettroforesi SDS-PAGE viene condotta in condizioni dette discontinue: il gel viene preparato in due tempi ed è diviso in due parti: STACKING GEL RUNNING GEL Running Buffer Il campione viene posto in una soluzione detta di LAEMMLI; questa contiene: SDS, -mercaptoetanolo, blue di bromofenolo, glicerolo, tampone. STACKING GEL: gel d’impaccamento o compressione 4% acrilammide; pori molto grandi; vi si formano i pozzetti di caricamento del campione RUNNING GEL: gel separatore; solitamente 7.5-15-20% acrilammide; (RESOLVING)

10. Elettroforesi SDS-PAGE: separazione molto efficiente delle proteine solo in base al P.M. Per questo è la base di molte altre tecniche di analisi e valutazione delle proteine in un campione biologico. Il doppio gel “discontinuo” che viene preparato consente la compressione delle proteine in una linea sottile nello stacking gel prima di entrare nel gel separatore. Questo si realizza attraverso la diversa composizione di (esempio): STACKING GEL: poliacrilammide al 3-5% (4%), Tampone Tris HCl 0,125M, pH 6.8 + SDS RUNNING GEL: poliacrilammide al 7.5-20%, tampone Tris HCl 0.37M, pH 8.8, + SDS Tampone di corsa: viene posto in contenitori posti sup e inf al gel e nella camera del gel: Tris-glicina pH 8.3, + SDS. Glicina: AA, acido debole. Nello stacking gel: gli ioni Cl-si muovono velocemente verso l’anodo (estremità inf del gel a bassa resistenza) mentre le proteine migrano più velocemente della glicina che rimane indietro (zona del gel superiore ad alta resistenza); migrando tra la glicina e gli ioni Cl- le proteine si “comprimono” e si allineano tutte su una linea sottile, anche grazie ai pori larghi dello stacking gel (3-5% acrilammide). Nel running gel: gli ioni glicina a pH 8.8, sono più carichi neg. e si muovo + veloci delle proteine, e sono loro che portano la corrente. Le proteine rallentano e si separano in base al PM.

11. SDS-PAGE: Per monitorare la corsa elettroforetica: – si controlla la posizione sul gel del blue di Bromofenolo (fa parte della soluzione di LAEMMLI), indicatore di migrazione; sostanza colorata a basso P.M. , con carica negativa, migra + veloce della proteina + piccola. • Si utilizzano uno o più pozzetti per caricare dei campioni di riferimento standard • proteine a PM noto che indicano la migrazione di proteine a PM simile. • A fine corsa il gel è trasparente e le proteine da valutare devono essere colorate x • essere visualizzate.

12. COLORAZIONE DEL GEL Il gel può essere colorato con diverse metodiche: Blue comassie (100 ng), colorazione silver-staining (1ng), colorazione reversibile con Zn o Cu. Colorazione con coloranti fluorescenti. Colorante di Coomassie: brilliant blue R-250, in isopropanolo, acido acetico. La miscela fissa le proteine e impedisce che vengano lavate via durante la colorazione. Il gel viene decolorato in isopropanolo, acido acetico senza colorante. logPM

13. Il gel di elettroforesi PAGE delle proteine è il punto di partenza per altre metodiche: Per conservarlo a lungo termine, può essere essiccato; si conserva in glicerolo tra due foglietti di plastica; può essere fotografato dopo la colorazione; può essere utilizzato nell’analisi di singole proteine che vengono individuate e misurate – tecnica del Western blot.