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Titre de l’atelier : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires

Titre de l’atelier : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires. Intervenant(s) : Lauranne Paillard; Virginie Goubert. Atelier protéomique fonctionnelle : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires.

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Titre de l’atelier : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires

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Presentation Transcript

  1. Titre de l’atelier : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires Intervenant(s) : Lauranne Paillard; Virginie Goubert

  2. Atelier protéomique fonctionnelle : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires

  3. Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires Partie 1 Présentation de la plate forme Lauranne Paillard-Laurance Ingénieure Partie 2 Présentation des technologies Alpha et Label free Virginie Goubert Drug discovery application specialist Partie 3 Applications et exemples réalisés sur la plate forme Lauranne Paillard-Laurance Ingénieure

  4. Interactions Moléculaires Puces ACTivités L. Paillard-Laurance Gen2Bio 3 avril 2014 Saint-Malo

  5. Mer Santé Agro Bio-informatique Le réseau Biogenouest http://www.biogenouest.org 6axes technologiques : 4domaines d'activité 29 plates-formes technologiques Plus de 70 unités de recherche • Génomique • Protéomique • Exploration fonctionnelle • Bio-imagerie • Analyse structurale et métabolomique • Bio-informatique

  6. Rennes Nantes Axe ProtéomiqueAnimateur : Charles Pineau & P. Weigel Identification–Caractérisation à haut débit Charles Pineau Interactions moléculaires puces activités (IMPACT) Yannick Jacques et Pierre Weigel

  7. Protéomique Caractérisation des PROTEines exprimées par un génOME dans un système biologique déterminé. Etude des protéines à grande échelle par des méthodes de biochimie et de biologie structurale en relation avec les données du génome Trois domaines: • Cartographie et identification des protéines • Analyse des interactions / recherche de partenaires • Structure / Fonctions

  8. Interactomique Etude de l’ensemble des interactions entre les protéines d’un organisme Objectifs • Connaître la liste des gènes et des protéines d’un organisme • Savoir comment ces éléments interagissent En pratique • Déterminer quelles protéines interagissent avec quelles autres • Dans un milieu dynamique (cellule vivante) Innombrables réactions chimiques à chaque seconde Solutions 1. Etudier le contenu (cartographie) 2. Etudier les interactions dans leur contexte cellulaire naturel 3. Etudier dans le détail chaque interaction Dans un système biologique donné

  9. Les 3 activités de la plateforme Impact 1. Activité de services 1. Aide méthodologique 2. Projets collaboratifs 2. Activité de R&D 3. Activité de formation 50 % de projets en interne 50% de projets externes Démarche qualité – certification Iso 9001 à court terme

  10. Pourquoi venir sur la plate forme Impact ?

  11. Activité niche en protéomique fonctionnelle • Expertise : • Profiling de l’expression protéique • Criblage d’activités biologiques • Caractérisation / Validation des interactions • Applicationsdans les domaines de la santé et des biotechnologies

  12. Equipements de la plate forme Impact Biacore 2000 / 3000 SPRiplex II Technologies Alpha et Label Free EnSpire Puces à protéines sciFLEXARRAYER S3 (Scienion) HTRF / BRET / FRET / AF Mithras LB940 Fluorescence/anisotropie fluorescence Spectrofluorimètre FP-6500 Photomètre de polarisation de fluorescence FP-715 Dichroïsme Circulaire et linéaire Spectropolarimètre J-810 Microcalorimètre Auto iTC200

  13. Equipements de la plate forme Impact Technologies Alpha®et Label Free Sur l’EnSpire

  14. Alpha Technology

  15. Alpha®: Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay Bead-based - Donor and Acceptor Beads Homogeneous - no wash steps Versatility - Detects virtually any molecule from large endogenous protein complexes to very small peptides Works in a variety of sample types including serum, plasma, cell lysates and cell supernatant High sensitivity (fmol) - Amplified signal Low background - Emission wavelength is lower than Excitation

  16. Alpha Toolbox for Assay Development • Donor Beads • Unconjugated • Ni2+ chelate • Glutathione (GSH) • Protein A • Anti-FLAG • Anti-mouse IgG • Anti-Rabbit IgG • Strep-Tactin • Optimization kits • TruHits • Omnibeads • AlphaLISA Acceptor Beads • Protein A • Protein G • Protein L • Anti-human IgG • Anti-rabbit IgG • Anti-mouse IgG • Anti-mouse IgM • Anti-rat IgG • Anti-goat IgG • Anti-sheep IgG • Anti-chicken IgY • Streptavidin • Nickel chelate • Glutathione (GSH) • Anti-FLAG • Anti-GST • Anti-c-myc • Anti-DIG • Anti-FITC • Anti-V5 • Anti-GFP • Anti-MBP • Strep-Tactin

  17. Alpha: A broad assay platform • Homogeneous assays: • Few steps, faster data generation • Improved CV compared towash assays • Reduced consumption of sample • Compatible with multiple types of samples • >120 Biomarker kits (immunoassays – ELISA conversion) • 86 SureFire kitsfor protein phosphorylation • >20 reagents to measure the activity of epigeneticenzymes • > 10 kits for cell-based epigenetics assays • cAMP, cGMP determination • Biotherapeuticsanalysis: PK, PD, ADA assays (immunoassays), clone screening, isotyping, functional testing, Host-cell contaminants , … • Toolbox: Even moreflexibilityto develop: • Other biomarkers, all the above but as custom kits, ... • Protein-protein interactions, Protein-DNA interaction, Protein-RNA interaction, Protein-small molecule interaction, Cellular markers or signaling, Biochemical Binding Assays…..ie. Receptor + Ligand/Mab Virtually any assay can be developed, as long as you can bring the beads together

  18. m [GST-HDM2] (nM) IC ( M) 50 1 0.61 2 0.58 5 0.90 10 1.10 Low affinity protein-protein interaction:p53/hDM2 (µM range) 400000 300000 AlphaScreen Signal (cps) 200000 Total Non Specific 100000 0 p53 peptide 0 2 4 6 8 10 12 [GST-HDM2] (nM) anti GST 400000 300000 AlphaScreen Signal (cps) 200000 100000 0 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 log [p53 peptide] (M)

  19. Cellular assay for measuring p65-IkBa interaction

  20. AlphaLISA comparison to ELISA How does AlphaLISA compare to traditional ELISA? AlphaLISA is bead based, technically different…but similar in functionality (sandwich assay in solution) No wash vs wash (time consuming) Scalable (from 96-well to 1536-well) Very wide dynamic range AlphaLISA • 2-incubation step protocol for most assays: • Just 4 steps to results • Add standard or sample • Add mix: biotinylatedAb& accbeads • 60 min incubation • Add donor beads • 60 min incubation • Read ELISA

  21. Alpha Molecular Weight Range for Targets • AlphaLISA can cover a wide range of sizes: • - Giant particles (100MDa+) ex. M13 phages • - Huge proteo-glycans (1MDa+) ex. chondroitine • - Large proteins (150kDa+) ex. hIgG • - Medium protein (50kDa+) ex. trimericTNFa • - Small protein (5kDa+) ex. insulin • - Large peptides (30aa+) ex. Aß42 • - Small peptides (5-30aa) ex. Angiotensin I • - Small molecules ex. cAMP

  22. Detection of phospho-Kinases in Cell lysates with SureFire kits • Homogeneous Cell-based assay • Highly sensitive: Over-expressed and endogenous receptors • Receptor-mediated signaling modulation: GPCRs, Receptors Tyr Kinases, Cytokine Receptors, Inflammatory responses • Intracellular kinase signaling cascade modulation: monitor a single target or multiple targets • Use in many different cell lines, incl. Primary Cells

  23. Measurement of ERK phosphorylation in Swiss 3T3 cells Stimulation of Endogenous Bombesin Receptors 120 100 AlphaScreen®SureFire™ Cellular ERK assay 80 % Activation 60 40 20 0 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Log [Bombesin] (M) Western blot pERK1/2 10 µM 40 pM [Bombesin] GPCR Activation

  24. Label-Free Technology

  25. PKI + Epic = EnSpire Label-Free Epic® Generation 2Label-free Reader EnSpire® Multimode Reader + = The First Multimode Bench-top Instrument With Label-free Capability For Both Cell-based & Biochemical Assays!

  26. PerkinElmer Label-free Enabled Microplates Body Split Grating Sensor High Quality Label-free Microplates Incorporate Patented Epic® Biosensor Technology

  27. Le principe de lecture La majeure partie de la lumière est transmise Fenêtre de détection 150 nm Source lumineuse à large spectre Longueur d’onde réfléchie Mesurée par le lecteur Mesure du changement d’indice de réfraction de la zone voisine du bio-détecteur (150 nm)

  28. Tests cellulaires Test biochimiques Ligand Cellule Redistribution de masse Protéine Applicable aux tests biochimiques ET Cellulaires Fenêtre de détection Liaison de molécules  Changement de masse  Changementd’indice de réfraction  Modification de longueur d’onderéfléchie Redistribution dynamique de masse  Changementd’indice de réfraction  Modification de longueur d’onderéfléchie

  29. Quelquesexemplesd’applications:

  30. Zone “Référence” Zone “Signal” Particularité des plaques pour tests biochimiques: L’autoréférençage • Deux zones danschaquepuits : référençage interne • Zone “Signal” : liaison covalente de protéines par couplage amine • Zone “Référence” : pas de liaison possible • Compensel’impact de facteursinfluençantl’indice de réfraction (DMSO, tampon, température, etc) • Lecture de chaque zone • sig – ref = réponsemesurée • Avantages pour le criblage de petites molécules& fragments: • Pas de puits “sacrifiés” pour les contrôlesnégatifs. • Facteur Z’ plus performantqu’enutilisant des puitscontrôlesadjacents < delta >

  31. Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Signal de base Signal post liaison Mesure (pm) Réponse = Liaison Longueur d’onde réfléchie Tampon Composé Zone Signal Zone Référence Principe de base du système Epic : tests biochimiques Lecture de la ligne de base Ajout de la protéine cible Ajout du composé Lavage Lecture finale Y Y Y Y Zone SignalZone Réf

  32. Dansylamide (250 Da) Literature KD: 760 nM Sulpiride (341 Da) Literature KD: 186 uM 12 10.0 9 7.5 Response (pm) Response (pm) 6 KD = 795 nM R2 = 0.98 5.0 KD = 127 uM R2 = 0.99 3 2.5 0 0.0 400 500 600 0 100 200 300 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Dansylamide (nM) Sulpiride (mM) Test de liaison de petites molécules à l’anhydrasecarbonique [drug] = 5uM Buffer = 1xPBS/0.1% DMSO N = 8 * CBS = 4-carboxybenzenesulfonamide

  33. Label-free détection d’activité cellulaire:

  34. Principe de base de la technolgie Epic: tests cellulaires Liaison du ligand au récepteur Fenêtre de Détection 150 nm  Redistribution de masse dans la cellule et/ou modifications morphologiques  Changement de l’indice de réfraction Y Y Cellule Surface Guide d’onde Substrat Lecture de la ligne de base λi Lecture finale Λf delta en pm signe la réponse cellulaire Source lumineuse large spectre Longueur d’onde réfléchie

  35. Receptor Tyrosine Kinases Toll-Like Receptors EGF in A431 cells dose-dependant activation of TLR3 in A549 Ion Channels Viral Infection Cytotoxicity Emetidine-induced toxicity on Cardiomyocytes HeLa cells Courtesy of Len Kaczmarek, Yale University Courtesy of Moonsoo Jin, Cornell University Le label-free peutmesurerdifférentesactivitéscellulaires … GPCR Cell-based applications

  36. En résumé… La technologieLabel-Free EnSpire • Estbaséesur les propriétés d’un détecteuroptiquemesurant des changementsd’indice de réfraction • Permetde réaliser des tests biochimiques et cellulairessans marquage • Estuneméthode de lecture non invasivepermettant de générer des profilscinétiquesriches en information • Permetd’éviter les faux positifsdûs à l’autofluorescence de composésou aux molécules de marquageelles-même • Estun système de haute sensibilité et rapide

  37. Activité niche en protéomique fonctionnelle • L’apport de l’EnSpire • Augmentation de la flexibilité/valeur ajoutée: • Biopuces en formats lames et microplaques • Plus grand choix du support en fonction du nombre d’échantillon à traiter • Approches complémentaires au SPRI et aux puces à protéines • Renforcement de l’expertise : • Profiling de l’expression protéique  AlphaLISA/AlphaScreen • Criblage d’activités biologiques  AlphaLISA/AlphaScreen et label free • Caractérisation / Validation des interactions  label free • Exemples d’applicationsdans les domaines de la santé et des biotechnologies

  38. Activité niche en protéomique fonctionnelle • Renforcement de l’expertise : • Profiling de l’expression protéique  AlphaLISA/AlphaScreen • Criblage d’activités biologiques  AlphaLISA/AlphaScreen et label free • Caractérisation / Validation des interactions  label free • Exemples d’applicationsdans les domaines de la santé et des biotechnologies

  39. AlphaScreenSurefire : exemples Taux de phosphorylation basal de STAT5 lorsque les cellules sont résistantes à un traitement Cellules sensibles au traitement Cellules résistantes au traitement

  40. AlphaScreenSurefire : exemples Phosphorylation de STAT5 sur 2 lignées cellulaires stimulées par différentes cytokines Kit 225 32Dβ Cytokine 1 Cytokine 1 Cytokine 2 Cytokine 3 Cytokine 1 Cytokine 2 Cytokine 3

  41. AlphaScreenSurefire : exemples Suivi du taux de STAT5 phosphorylé suivant le temps de stimulation par différents agonistes Composé 1 Composé 2 Composé 3

  42. Label free : test biochimique Interaction de Rad51 avec l’ADN WT mutant 1 mutant 2 mutant 3 ADN biot Rad51 Avec ATP streptavidine WT mutant 1 mutant 2 mutant 3 1 CoatingStreptavidine 2 Fixation ADN biot 3 Lecture ligne de base 4 Ajout Rad51 5 Lecture Sans ATP

  43. Label free : test biochimique Binding d’un composé chimique sur une protéine Composé chimique 500 Da 1 Coating protéine 2 Lecture ligne de base 3 Ajout composé 4 Lecture Protéine 25 KDa

  44. Organigramme Responsables scientifiques IRS Yannick Jacques, UMR INSERM U892 CNRS 6299 Faculté des sciences Pierre Weigel UMR CNRS UFIP/ Université de Nantes Institut de Recherche en Santé de l'Université de Nantes (IRS-UN) Responsable technique Cathy Charlier, IE Université Tel. 02 51 12 56 - cathy.charlier@univ-nantes.fr Responsable technique Mike Maillasson, IE INSERM Tel. 02 28 08 03 79 - mike.maillasson@univ-nantes.fr Enspire Label free Lauranne Paillard IE BRET/FRET-HTF Fabien Gautier CR Puce à protéine Microcalorimétrie Biacore - SPRi Enspire Technologie alpha Lauranne Paillard IE Dichroïsme circulaire, Fluorescence et anisotropie de fluorescence Fabrice Fleury Technicalapproaches for BioManufacturing , Biomarker & Drug Discovery services Ingénieur Qualité – Lauranne Paillard IE

  45. Contacts Mike Maillasson Institut de Recherche Scientifique Centre de Recherche en Cancérologie (CRCNA) 8, Quai Moncousu - 44 007 NANTES Cedex1 Tel. 02 28 08 03 79 mike.maillasson@univ-nantes.fr Cathy Charlier Faculté des sciences 2 rue de la Houssinière - 44322 Nantes CEDEX 3 Tel. 02 51 12 56 21 cathy.charlier@univ-nantes.fr http://www.impact-plateforme.com

  46. The End

  47. Back up slides

  48. AlphaLISA Kits

  49. AlphaScreenSureFire : 45 biomarkers Cancer 4EBP1 (T70 and T37/46) Immunity MEK-1 (S217/221) ERK 1/2 (T202/Y204) Total ERK ½ Elk-1 (S383) Chk1 (S345) Chk2 (T68) RPS6 (S235/236, S240/244) Caspase 9 (S196) Total ALK ALK (Y1586) ALK (Y1604) c-Jun (S63, S73) MKK3/6 (S189 or S207) P38 MAPK (T180/Y182) Stat-1 (Y701) Stat-3 (Y705) Stat-5 (Y694/699) eiF4E (Ser209) Smad 2 (S465/467) Smad3 (S423/425) EGF receptor (Y1068) ErbB2 (Y1221/1222) VEGF receptor 2 (Y1175) Total Akt1 Total Akt 1/2/(3) Akt 1/2/3 (T308) Akt 1/2/3 (S473) Akt1 (T308) Akt1 (S473) mTOR (S2481, S2448) p70S6K (T229, T389, T421/S424) PDK-1 (S241) IkBα (S32/36) IKKα (S176/180) IKKß (S177/181) NFkB p65 (S536) IGF-1 receptor β (Y1135/1136) Insulin receptor β (Y1150/1151) GSK3α (S21) GSK3ß (S9) JNK1/3 (T183/Y185) Diabetes BAD (S112) BAD (S136) Inflammation Internal Standard CNS & Neuro-degeneration total GAPDH

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