1 / 55

Granulocyttfunksjons undersøkelser

Granulocyttfunksjons undersøkelser. Haakon Sjursen Universitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus 2013. Celler i blod. Den nøytrofile granulocytt. Immunforsvarets raskeste Produksjon > 1 x 10 11 /døgn ca . 1500 kg per 80 åring Rask turnover: ~ 10 t i blod Evt . 1–2 døgn i vev

fisseha
Download Presentation

Granulocyttfunksjons undersøkelser

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Granulocyttfunksjons undersøkelser Haakon Sjursen Universitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus 2013 H.Sjursen

  2. Celler i blod H.Sjursen

  3. Den nøytrofilegranulocytt • Immunforsvarets raskeste • Produksjon > 1 x 1011 /døgn • ca. 1500 kg per 80 åring • Rask turnover: ~ 10 t i blod • Evt. 1–2 døgn i vev • Endestadiecelle: effektorcelle • Cytokinprodusent H.Sjursen

  4. 3 linjer i forsvaret mot infeksjon (Innate immune defence) H.Sjursen

  5. Andre linje forsvar - Fagocytose Fagocytose Gresk: fago = spise og cyto = celle • Fagocytose utføres av nøytrofile og monocytter/makrofager • Nøytrofile dominerer tidlig i infeksjonen • Makrofager er monocytter som forlater blodbanen og utvikles til makrofager som vandrer i vev • Histiocytter er makrofager lokalt i lever, nervesystem, lunger, lymfeknuter, beinmarg o.a. vev H.Sjursen

  6. Den nøytrofile granulocytt • Marginasjon • «Rolling» langs endotelveggen • Adhesjon • Migrasjon • Diapedese (emigrasjon) • Kjemotakse • Fagocytose • Intracellulært drap • NB: kan ha nedsatt funksjon tross normale granulocytter: • Ved antistoffmangel eller komplementmangel H.Sjursen

  7. Marginasjon - Adhesjon - Migrasjon - Diapedese H.Sjursen

  8. A neutrophil adheres to the endothelium in a venule (1). It extends its pseudopodium between the endothelial cells and migrates towards the basement membrane (2). After the neutrophil has crossed into the tissue, the endothelium reseals behind (3). The entire process is referred to as diapedesis. (Courtesy of Dr I Jovis) H.Sjursen

  9. Kjemotakse: Fagocyttene trekkes til Infeksjonsfokus H.Sjursen

  10. Klassisk og alternativ komplement pathways trigger spalting av C3 H.Sjursen

  11. Membran Attack Complex (MAC) forårsaker cytolyse H.Sjursen

  12. H.Sjursen

  13. H.Sjursen

  14. H.Sjursen

  15. Reseptorer og signal interaksjoner ved fagocytose av mikrober(Underhill DM, Ozinsky A, Annu Rev Immunol 2002, 20, 825 Mange reseptorer er involvert. Svikt i én reseptorgruppe kan delvis kompenseres om andre reseptorer er normale H.Sjursen

  16. Stadier i fagocytose -1 • Adheranse: Fagocyttens plasmamembran fester seg til bakterien • Hemmes av kapsel (pneumokokker) og M protein (GAS) • Opsonisering: Coating prosess med opsoniner som letter feste • Opsoniner: Antistoff og komplement 2. Internalisering: Plasmamembranen på fagocytten danner pseudopoder som omgir mikroben 3. Mikroben omsluttes av en sekk kalt fagosom 4. Intraacellulært drap: Fagosomet fusjonerer med lysosomet og danner fagolysosomet H.Sjursen

  17. Phagocytose H.Sjursen

  18. Stadier i fagocytose -2 5. Lysosomaleenzymer dreper bakterien innen 10 sec – 20 min. • O2 uavhengig • Lysozym: Ødeleggerpeptidoglykan i bakteriens cellevegg • Lipaser • Lactoferrin • Proteaser • RNAser og DNAser 6. Etter nedbryting dannes residuallegemet med ufordøyelig materialer som blir utskilt fracellen H.Sjursen

  19. Oxidativburst O2 - avhengig a) Myeloperoxidase (MPO) b) MPO- uavhengig 1. H2O2 2. Superoxid anion O2¯ 3. Hydroxyl radikal OH ¯ 4. Singlet oxygen O2* 5. Ascorbat-peroxid-metall ion 6. Aminosyre oksidasjon 2O2 + NADPH 2O2¯ + H+ + NADP + 2O2¯ + 2H+ H2O2 + O2 H.Sjursen

  20. H.Sjursen

  21. Elektronmikroskopi av en granulocytt som har internalisert Staphylococcus aureus (S) H.Sjursen

  22. Intracellulær lokalisering av bakterier Fusjon Lysosom B 3 pH=7.4 Fagosom Fagolysosom B 4 B 1 S.aureaus Brucella Salmonella Coxiella burneti pH=5.0 B B Chlamydiae Legionella Mycoplasma 2 B Ingen fusjon med lysosomet Listeria Cytoplasma

  23. Intracellulær lokalisering av antibiotika Fagolysosom volum 1 to 5% av cellevolumet pH=5.0 Cytoplasma Fagosom pH=7.2 Fluoroquinoloner (x2-8) beta-lactamer (x0.2-0.6) Rifampicin (x2) Aminoglycosides (slow) Macrolider (x10-50) Aminoglycosider (x2-4) Tetracykliner Fluoroquinoloner

  24. Intracellulær antibiotika aktivitet Cytoplasma PH 7.2 Fagosom pH 7.2 Listeria Fagolysosom pH 5.0 Fluoroquinoloner beta-lactamer* Rifampicin Aminoglycosider Macrolider God Macrolider Aminoglycosider Lav eller 0 Fluoroquinoloner, Doxycyclin God S aureus Brucella Salmonella Coxiella Chlamydia Legionella Mycoplasma *Husk:Mycoplasma, Chlamydia, Legionella har ikke cellevegg: β-lactamer virker ikke!

  25. Fagocyttfunksjons undersøkelser • Måles ved Fagocytose laboratoriet ved Institutt for Indremedisin, Universitetet i Bergen • Nasjonal referanse laboratorium • Hva måles: • Kjemotakse • Fagocytose • Intracellulært drap • Reseptor ekspressjon: Fc- , komplement reseptorer o.a. • Hvorfor: Fordi det finnes medfødte og erværvede defekter i alle disse funksjonene H.Sjursen

  26. Kjemotakse defekter • Normalt: →1.8 mm/t • Nedsatt ved: Noen infeksjoner Brannskader Malignitet Underernæring Revmatoid arthritt Diabetes mellitus • Komplement mangel/defekter • Inhibitorer (SLE o.a. autoimmune sykdomer • Cellulær svikt: Chédiak-Higashi syndrom • Immunglobulinmangel (IgA, IgG 1-4) • Hyperimmunoglobulinemi E (Job’s syndrom) • Hypofosfatemi • Opsonindefekter • Mannan bindende protein (Lectin) mangel H.Sjursen

  27. NøytrofiledefekterDefekt i nøytrofil- avhengig immunforsvar Kvantitativ Nøytropeni – den vanligste • Ervervet • Medikament indusert • Autoimmun • Cancer • Leukemi • Hereditær • Familiær benign (etnisk) nøytropeni • Infantil genetisk agranulocytose (Severe congenitalneutropenia) • Cyklisknøytropeni H.Sjursen

  28. Kvantitative Granulocyttfunksjons defekter • Leukemi, aplastisk anemi, nøytropeni, brannskader, sepsis, diabetes, underernæring, AIDS, nyfødte • Hyppigere og alvorligere infeksjoner • Ofte med spesielle mikrober • Rammer ofte mononukleære fagocytter tilsvarende • Funksjonsdefekten fører til lite kliniske funn tross fulminant infeksjon • Sjelden sepsis og meningitt H.Sjursen

  29. Kvalitative nøytrofile defekter • Adhesjonsdefekter • Leukocytt adhesions mangel (LAD) • Type 1 Integrin mangel • Type 2 E-selectin ligand mangel H.Sjursen

  30. Defekter i intracellulært srap • Abnormalt respiratory burst • Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) • Glukose-6-fosfat mangel • Granula abnormaliteter • Myeloperoxidase mangel • Spesifikke granula mangler • Chédiak-Higashi syndrom H.Sjursen

  31. Nøytrofil og lymfocytt fra en pasient med Chediak-Higashi syndrom. Store dysmorfe granula (se pil) H.Sjursen

  32. Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) • 1: 250 – 500 000 (?) • 70% x-bundet recessiv • Mutasjoner i gener for 4 plasmamembran proteiner • Svært nedsatt H2O2produksjon • Excessiv inflammasjon med granulomer • DHR-test (Dihydro-rhodamin for intracellulært drap) H.Sjursen

  33. Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) • Alvorlige infeksjoner i hud, øre, lunger, lever, bein • Gingivitt, aphter • Infeksjoner med katalase-produserende mikrober: • Staphylococcus aureus • Bacillus cepacia • Aspergillus Behandling: antibiotika og IFN-γ profylakse H.Sjursen

  34. Behandling av granulocytt defekter • Antibiotika profylakse • Granulocytt transfusjon (CGD) • Beinmargs transplantasjon • Gen terapi (CGD) • Stamcelle transplantasjon • CD34 H.Sjursen

  35. Granulocyttfunksjonsundersøkelser • Kjemotakse • Fagocytose (og drap) • Oxidative burst (DHR-test) • Reseptorundersøkelser • Fc-reseptorer (CD16, 32, 64) • C-reseptorer (CD11/CD18, CD35) • IFNγR1 • Toll-like reseptorer (2 og 4) H.Sjursen

  36. Kjemotakse H.Sjursen

  37. Transwellkjemotaksi plate Granulocytter: porestr. 3 µm Monocytter: porestr. 5 µm H.Sjursen

  38. 96 brønners celle cultur plate i polypropylen m rund bunn til flowcytometer ELISA plate Incubator/ Shaker (Labsystems i EMS) til kjemotaksi, fagocytose, ic. drap H.Sjursen

  39. Flowcytometer (Cytomics FC 500 MPL (Multi-plate loader) • Væskestrømscytometri • Fagocytose og oxidativburst • S. aureus og opsonisertzymosan • Fc- og Komplement reseptormåling H.Sjursen

  40. H.Sjursen

  41. Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS) H.Sjursen

  42. Med to lasere H.Sjursen

  43. Med 3 lasere Med 3 lasere Gir 5 farger Med 3 lasere Med 3 lasere 5 Color FACSort optical layout H.Sjursen

  44. FCM sorting av 3 ulike alger H.Sjursen

  45. Flow cytometer output of BacLight® stained marine bacteria. BacLight® is a dual nucleic acid stain that causes live bacteria to fluoresce green and dead bacteria to fluoresce red when excited with the 488 nm argon laser of the flow cytometer H.Sjursen

  46. Ly Celle-debris RBC Granulocytter Mo H.Sjursen

  47. gran Mo Ly H.Sjursen

  48. Flowcytogram for Oxidativ burst Samme prinsipp for fagocytose og receptormåling med flere fluoriserende farger H.Sjursen

  49. OXIDATIVT BURST – INTRACELLULÆRT DRAP H.Sjursen

  50. H.Sjursen

More Related