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新的里程碑： TALEN 靶向基因敲除

新的里程碑： TALEN 靶向基因敲除. 北京康为世纪生物技术有限公司. 北京康为世纪生物科技有限公司. 王春香 博士 执行董事兼总经理 北京大学生物系学士和硕士学位 美国加州大学洛杉矶分校（ UCLA ）病理系博士学位。 1999 年回国 2002 年创办北京天为时代科技有限公司 2005 年被 QIAGEN 收购 - 天根 2007 年底创建康为世纪 目标：成为中国的 Invitrogen. 北京康为世纪生物科技有限公司. 完善的产品线. 一站式服务平台. 实验设计平台 分子生物学平台 蛋白表达与纯化 平台 抗体制备纯化平台

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新的里程碑： TALEN 靶向基因敲除

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Presentation Transcript

  1. 新的里程碑：TALEN靶向基因敲除 北京康为世纪生物技术有限公司

  2. 北京康为世纪生物科技有限公司 • 王春香博士执行董事兼总经理 • 北京大学生物系学士和硕士学位 • 美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）病理系博士学位。 • 1999年回国 • 2002年创办北京天为时代科技有限公司 • 2005年被QIAGEN收购 - 天根 • 2007年底创建康为世纪 • 目标：成为中国的Invitrogen

  3. 北京康为世纪生物科技有限公司 完善的产品线 一站式服务平台 • 实验设计平台 • 分子生物学平台 • 蛋白表达与纯化 • 平台 • 抗体制备纯化平台 • 免疫学检测平台 康为世纪生物科技有限公司 我们的客户 我们的合作伙伴 • 北京大学、清华大学、 复旦大学 • 中国科学院、军事医学 科学院 • 301医院、协和医院、 上海瑞金医院 • 华大基因、诺华制药 • 分子生物学 全系列产品 • 蛋白生物学产品 • 免疫学相关产品

  4. 江苏泰州中国医药城 • 临床诊断试剂研发及中试平台 • 3000平米实验室及GMP厂房

  5. 崭新的技术解决经典的挑战 崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 - 基因敲除（Knockout） 什么是基因敲除 - 通过某种方法将一个特定的目标基因破坏，使其失去原有的功能。 为什么要做基因敲除 - 基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一。 寻找、证明一个基因的功能都需要哪些步骤？

  6. 科研论证基本法则 科霍法则 （Koch‘s postulates ） 如何证明某种微生物导致了某种疾病？ • 该种微生物存在与患病个体而不存在于健康个体。 • 该种微生物可从患病个体上分离出来并体外培养。 • 当把该种微生物接种入健康个体体内时可使健康个体患病。 • 从人为接种的患病个体中又可分离得到该种微生物。 Robert Koch 1843 – 1910

  7. 科研论证基本法则 Falkow的分子科霍法则（Falkow’s molecular Koch‘s postulates） 如何证明一个基因编码一种毒力因子？ • 该基因存在于毒力菌株，而不存在于无毒菌株。 • 当该基因被敲除时菌株毒力消失或下降。 • 当该基因被补回（敲除）突变菌株时毒力得到恢复。 Reverse genetics

  8. 为什么要做基因敲除？ • 基因敲除是证明基因功能不可缺少的逻辑环节 • 基因敲除是基因工程和基因治疗的重要手段

  9. 怎样做基因敲除？ • 经典方法 ：自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！ • 革命性的进步：RNAi – 临时性，不完全敲除 – Knockdown • 饱含希望与失望的技术：ZFN • 新的里程碑：TALEN

  10. TALEN技术原理 • 基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，其本质是一个转录调控因子，主要有两个重要的结构域：特异性识别靶核酸序列的靶点识别域，切断DNA序列的核酸酶功能结构域。 • 靶点识别结构域的组成 • 17 -18个34aa重复序列 • 34aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) • 对应识别一个目标碱基 靶向敲除

  11. TALEN发展过程 • 1989年，植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.）avrBs3 基 因被克隆。 • 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 - TA • 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译

  12. TALEN的最前沿 • 2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。 • 一篇人类干细胞 • 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 • 一篇大鼠 • 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》 • 两篇斑马鱼 • 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 • 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 • 一篇综述 • 《Move over ZFN》

  13. TALEN基因敲除基本流程 • 确定靶点：选择目标基因外显子中相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点 2. TAL靶点识别域的克隆构建 3. 将TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体以表达重组核酸酶 4. 将重组真核表达质粒转入（卵）细胞 5. 筛选突变体

  14. 构建TAL靶点识别域 • TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD） • RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确 • 欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14 -18个）串联克隆即可。

  15. 具专利保护的克隆构建系统

  16. 具专利保护的克隆构建系统 步骤一：靶点识别单元串联

  17. 具专利保护的克隆构建系统 步骤二：TALEN表达质粒构建

  18. 真核表达TALEN质粒对 将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。 X 2

  19. FOKI 内切酶打断靶点区 步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除 TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。

  20. 突变体形成 内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。

  21. 突变体筛选 利用实验设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，可进行PCR产物酶切鉴定以筛选发生目标基因敲除的突变个体。当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测

  22. TALEN介导的同源重组 HR 同源重组发生率升高几个数量级 Donor plasmid

  23. 锌指蛋白核酸酶（ZFN） 基因敲除 • 约30aa模块，在锌离子帮助下形成“ββα”结构。其中构成alpha螺旋的6aa可特异识别3连碱基 • 不是任意三连碱基组合都有对应模块 – 靶点选择受限 • ‘上下文效应’（context effect）- 模块单元对3连碱基的识别特异性受相邻模块影响 - 模块串联构建方法基本不实用 • 通常用3 – 4个模块构成靶点识别域 • Off-targeting现象严重

  24. ZFN off-targeting 原因

  25. 基本工具质粒 怎样做TALEN • 1单元模块质粒：A，G，C, T共4种 • 2单元模块质粒：4X4=16种 • TALEN表达载体：2种 14 – 18bp靶点序列

  26. 怎样做TALEN

  27. 怎样做TALEN

  28. TALE技术应用展望 • 靶向基因表达调控 • 靶向基因敲除- NHEJ • 靶向基因敲入-HR • 基因治疗 例如：chemokine receptor 5（CCR5）基因

  29. 谢谢！ • 北京康为世纪生物技术有限公司 • 总机010-58851919      4006-222-360 • 订购 010-58851919-618 • Order@cwbiotech.com • 技术支持 010-58851919-615/616 Support@cwbiotech.com • 市场部 010-58851919628 Marketing@cwbiotech.com

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