Podsumowanie – wykład 4

1. Podsumowanie – wykład 4 • Metoda amplifikacji 3’i 5’ końców cDNA (RACE PCR) • Wektory plazmidowe do klonowania – test selekscyjnybiałych i niebieskich kolonii bakteryjnych • Metody analizy ekspresji pojedynczych genów i całych transkryptomów • Northern- blot • Technika ochrony przed aktywnością RN-azy (RPA) • Półilościowy RT-PCR (warunki reakcji, zasada amplifikacji) • Real Time PCR (warunki i zasada amplifikacji) • Analiza mikromacierzy DNA • Sposoby wyciszania genów (nokautowanie, iRNA, siRNA) – przykład wyciszania genu kodującego syntazęchalkonową CHS u roślin z rodziny goryczkowatych i petuni.

2. 5’ 1 214 1602 3’ 3175 pz. RACE –RapidAmplification of cDNAEnds GeneRacerTM RACE ReadycDNA Kit Manual (Invitrogen) • Technika szybkiej amplifikacji 3’ i 5’ końców cDNA (RLM-RACE) • Charakterystyka regionów promotorowych • Otrzymywanie kompletnej sekwencji cDNA 3175-1359=1816

3. 214 GSP for GSP rev GenePacer 5’PRIMER gen pompy protonowej 1359pz. ATG GeneRacerOligo RNA GeneRacerOligo dT-3’ GeneRacer 3’PRIMER 1602 Schemat dobudowywania końców 3’ i 5’ do znanego fragmentu genu Dołączenie oligo(dT) przy użyciu terminalnej transferazy do końca 3’ Reakcja PCR z użyciem GSP (genespecificprimer) i primera komplementarnego do linkera oligodT (Gene Race 3’ Primer) Przyłączenie „adaptera” oligo RNA na 5’ Wzmocnienie swoistości amplifikacji przez PCR ze starterami swoistymi do kolejnych bardziej wewnętrznych regionów DNA („nested” PCR)

4. Zakotwiczony PCR – nested PCR „Zakotwiczony” PCR podnosi specyficzność i intensywność produktów RACE dla 5’ i 3’ końców badanego genu • Stosowany wówczas gdy otrzymujemy wiele transkryptów różnej wielkości lub „smary” po reakcji PCR • matrycą jest cDNA otrzymany po pierwszej reakcji PCR • startery typu „nested” dla 3’ i 5’ • -specyficzne • -GeneRacer

5. Białei niebieskie kolonie bakteryjne • Wykrywanie zrekombinowanych plazmidów • Gen LacZ kodujący b-galaktozydazę pod kontrolą promotora lac • W szczepie bakterii E. coli z represoremlac ekspresję genu lac indukuje się podając IPTG- izopropylo-beta –D- tiogalaktopiranozyd • Aktywna beta-galaktozydaza rozkłada substrat X-Gal (5-bromo-4chloro-3 indolilo-β-D-tiogalaktopiranozyd) prowadząc do powstania niebieskiego produktu • Insercja w genie lacZ prowadzi do inaktywacji enzymu stąd biała barwa kolonii.

6. PCR w czasie rzeczywistym (real timepcr) • Termocykler sprzężony z fluorymetrem, który umożliwia pomiar fluorescencji w trakcie trwania reakcji PCR • PCR z jednoczesną analizą przyrostu ilości produktu na podstawie fluorescencji • - wykrywanie produktu we wczesnych fazach reakcji • -monitorowanie kinetyki reakcji PCR w trakcie jej trwania • Ilość produktu po zakończonej reakcji powinna być proporcjonalna (wykładniczo) do początkowej puli cDNA • Wzrost fluorescencji jest proporcjonalny do liczy namnożonych cząsteczek DNA

7. Porównanie ekspresji metodą mikromacierzy • Izolacja RNA-- odwrotna transkrypcja--cDNA (wyznakowany barwnikiem fluorescencyjnym) -barwnik czerwony (Cy5) -barwnik zielony (Cy3) • Wymieszanie obu próbek cDNA • Hybrydyzacja z sondami w każdej plamce mikromacierzy • Wzbudzenie przez światło lasera – „plamka” będzie fluoryzować na czerwono jeśli -związała więcej czerwonego barwnika = nadekspresja genu w chorej tkance; odwrotnie plamka będzie fluoryzować na zielono jeśli ekspresja ulega obniżeniu w chorej tkance w porównaniu z tkanką prawidłową. http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM&feature=related

8. NokautowanieRNA – iRNA, siRNA Wprowadzenie różnego typu dwuniciowych RNA (iRNA, siRNA) do komórki prowadzi do degradacji transkryptówmRNA – wydajna metoda do wyłączania (nokautowania genu) w celu eliminacji jego funkcji; Wprowadzenie dodatkowych kopii genu kodującego syntazęchalkonowąnadającą płatkom petunii fioletową barwę zamiast nasycać barwą spowodowało,żestały się one miejscami białe. Wyciszenie genu syntazychalkonowejprzy użyciu iRNAu gatunków Gentianatriflora(goryczkowate) powoduje białe zabarwienie płatków