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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES

DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES. 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.

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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES

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  1. DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES

  2. 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

  3. 1°) Indications • a) Conseil génétique et diagnostic anténatal • b ) Diagnostic de confirmation • c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) • 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. • a) problèmes posés par les mutations récurentes • b) problèmes posés par les mutations inconnues • i) diagnostic direct évident • ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire • 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie • a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) • b ) analyse familiale • c) diagnostic probabiliste

  4. 1°) Indications • a) Conseil génétique et diagnostic anténatal • b ) Diagnostic de confirmation • c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) • 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. • a) problèmes posés par les mutations récurentes • b) problèmes posés par les mutations inconnues • i) diagnostic direct évident • ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire • 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie • a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) • b ) analyse familiale • c) diagnostic probabiliste

  5. 1°) Indications • a) Conseil génétique et diagnostic anténatal • b ) Diagnostic de confirmation • c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) • 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. • a) problèmes posés par les mutations récurentes • b) problèmes posés par les mutations inconnues • i) diagnostic direct évident • ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire • 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie • a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) • b ) analyse familiale • c) diagnostic probabiliste

  6. Recherche de mutations récurrentes Un gène – une mutation Un gène-des mutations majoritaires … de nombreux outils adaptés

  7. Allèles anormaux (> 36 CAG ) Allèles normaux ( 30 CAG) Maladie de Huntington

  8. ...Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine- Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine... Diagnostic Direct et analyse fonctionnelleSyndrome de retard mental lié à l ’X • Le Gène : • Gène FMR1, localisé en Xq27.3 • FMRP : RNA binding protéine • Présence d ’une expansion d ’un motif trinucléotidique répété « CGG » au niveau de l ’extrémité 5 ’non traduite du gène (CGG)n

  9. M M F H PM Diagnostic Direct Syndrome de retard mental lié à l ’X • Southern Blot Homme mosaïque Femme mosaïque Femme prémutée Homme prémuté Femme normale Homme normal Femme mutée Homme muté 5,2 kb EcoRI normal Muté Méthylé NI Prémuté No Méthylé 2,8 kb EcoRI+EagI normal NA Interprétation des profils Blot

  10. EXON M T M T MWM 45 pm 48 3 DystrophiemusculairedeDuchenne 19 43 17 50 5 13 8 6 12 47 44 60 52 4 Diagnostic direct d ’une lésion de l ’ADN par PCR Deux réactions permettent d ’amplifier simultanément à l ’aide de 18 couples d ’amorces spécifiques, 18 exons du gène de la dystrophine et les jonctions introns-exons correspondantes. Elles permettent ainsi de diagnostiquer la délétion d ’un ou plusieurs de ces exons chez les malades atteints de myopathie de Duchenne/Becker.

  11. ADN Normal C A Fluorochrome Sonde commune G G Oligonucleotide Ligation Assay Ligationdénaturation OLA Normal

  12. T A A Fluorochrome G Sonde commune ADN Muté Oligonucleotide Ligation Assay Ligationdénaturation OLA muté

  13. OLA

  14. 1°) Indications • a) Conseil génétique et diagnostic anténatal • b ) Diagnostic de confirmation • c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) • 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. • a) problèmes posés par les mutations récurentes • b) problèmes posés par les mutations inconnues • i) diagnostic direct évident • ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire • 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie • a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) • b ) analyse familiale • c) diagnostic probabiliste

  15. Recherche de mutations inconnues Techniques multiples de détection

  16. Size marker Undigested R317X Control Heterozygous Codon 317 CAG  TAG Controls nt 1311 CT Controlsnt 1311 CT Sequence PCR/HaeIII SSCP DGGE PAX6 Nonsense Mutations Exon 11 (R317X)

  17. 1°) Indications • a) Conseil génétique et diagnostic anténatal • b ) Diagnostic de confirmation • c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) • 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. • a) problèmes posés par les mutations récurentes • b) problèmes posés par les mutations inconnues • i) diagnostic direct évident • ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire • 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie • a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) • b ) analyse familiale • c) diagnostic probabiliste

  18. Critères d’implication d’une variation nucléotidique dans un phénotype (pathologique) • évident (modification radicale de la protéine) • Absence d’ARNm ou de protéine • Perte de la fonction de la protéine in vitro ou dans un modèle (test fonctionnel) • modification de l’ARNm • Arguments probabilistes • Histoire familiale • corrélations mode de transmission/ phénotype ; phénotype/génotype • Arguments biologiques (éventuellement in sillico) • nature du changement d’acide aminé • éloignement du consensus pour une séquence signal • ... • Comparaison en population • mutations comparables et leurs effets pathogènes • conservation du résidu modifié dans une famille de gène (intraspécifique) ou une analyse phylogénétique (interspécifique) • présence de la variation dans une population normale comparable

  19. 1°) Indications • a) Conseil génétique et diagnostic anténatal • b ) Diagnostic de confirmation • c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) • 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. • a) problèmes posés par les mutations récurentes • b) problèmes posés par les mutations inconnues • i) diagnostic direct évident • ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire • 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie • a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) • b ) analyse familiale • c) diagnostic probabiliste

  20. Marqueur 1 Ici Marqueur 2 Marqueur 3 Marqueur 4 Le Diagnostic Indirect

  21. 1°) Indications • a) Conseil génétique et diagnostic anténatal • b ) Diagnostic de confirmation • c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) • 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. • a) problèmes posés par les mutations récurentes • b) problèmes posés par les mutations inconnues • i) diagnostic direct évident • ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire • 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie • a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) • b ) analyse familiale • c) diagnostic probabiliste

  22. Diagnostic Indirect (affection AD)

  23. 1°) Indications • a) Conseil génétique et diagnostic anténatal • b ) Diagnostic de confirmation • c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) • 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. • a) problèmes posés par les mutations récurentes • b) problèmes posés par les mutations inconnues • i) diagnostic direct évident • ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire • 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie • a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) • b ) analyse familiale • c) diagnostic probabiliste

  24. 1cM + m 3cM ou + m ou + m ou + m P=0,01 P=0,0003 P=0,03 Phénomène de recombinaison

  25. 4°) Prescription • a) consultation préalable appropriée • b) obtention du consentement éclairé • c) rendu des résultats • 5°) Le diagnostic anténatal • a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) • b) obtention du consentement éclairé • c) prise en charge de la grossesse en cours • d) rendu des résultats • e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

  26. 4°) Prescription • a) consultation préalable appropriée • b) obtention du consentement éclairé • c) rendu des résultats • 5°) Le diagnostic anténatal • a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) • b) obtention du consentement éclairé • c) prise en charge de la grossesse en cours • d) rendu des résultats • e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

  27. Le consentement éclairé Obligatoire doit porter sur des renseignements précis doit faire l’objet d’un document écrit doit être compris par le patient ou ses ayant-droits Les cas particuliers enfants les titulaires de l’autorité parentale et éventuellement l’enfant lui même les majeurs incapacités tuteur ou curateur les impossibilités personne de confiance déclarée famille L’attestation d’obtention du consentement. • Le consentement éclairé • Unicité de la recherche • Autorisation du laboratoire • Découvertes fortuites • Incertitude sur le succès • Durée des examens • Conservation des échantillons • Modalités de rendu diagnostique • Caractère facultatif

  28. 4°) Prescription • a) consultation préalable appropriée • b) obtention du consentement éclairé • c) rendu des résultats • Abord du patient • Lecture d’un compte rendu d’analyse moléculaire pour le praticien • 5°) Le diagnostic anténatal • a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) • b) obtention du consentement éclairé • c) prise en charge de la grossesse en cours • d) rendu des résultats • e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

  29. Rendu des résultats • par le médecin prescripteur du test • qui est le seul destinatiare des résultats… • Au cours d’une consultation appropriée • Eventuel suivi • Lecture d’un compte rendu de diagnostic moléculaire à l’usage du praticien • Notion de nomenclature internationale des mutations

  30. Nomenclature des mutations • Description au niveau nucléotidique • Base de description • la séquence génomique : g. • La séquence de l’ADNc : c. • Les substitutions • g.11223G>A = substitution d’une guanosine par une adénosine en position 11223 de la séquence • c.542T>C (le nucléotide N° 1 est le premier nucléotide du codon d’initiation de la traduction (A de l’ATG)) • Cas des introns • c.641+2T>A ou IVSn+2T>A • c.642-1G>T ou IVSn-1G>T • Séquence de référence précisée. • Les délétions et les insertions • « del » ou « ins » • c.266_271del6 ou c.266_271delTTACCA

  31. Description au niveau protéique • p.Q36X ou p.Gln36stop ou p.Gln36X • p.R40W ou p.Arg40Trp • Description de mutation à effet plus complexe • Exemple mutations décalantes du cadre de lecture • c.642_643insCfsX18 • p.Ala214AlafsX6 • Lecture du compte rendu • 1°) la technique employée • 2°) le résultat brut • Présence d’une mutation [c.24C>T]+[=] dont l’impact protéique est [p.Lys8Arg]+[=] • 3°) le commentaire • La mutation p.Lys8Arg présente à l’état hétérozygote est décrite de manière récurente dans la population européenne. Elle est responsable du phénotype du patient. Elle se transmet en dominance et, sa présence doit faire conseiller une consultation spécialisée de génétique pour informer le proposant des risques et engager une éventuelle enquête familiale.

  32. Précisions, questions et description des mutations complexes : • http://www. dmd.mutnomen.html

  33. 4°) Prescription • a) consultation préalable appropriée • b) obtention du consentement éclairé • c) rendu des résultats • 5°) Le diagnostic anténatal • a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) • b) obtention du consentement éclairé • c) prise en charge de la grossesse en cours • d) rendu des résultats • e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

  34. 4°) Prescription • a) consultation préalable appropriée • b) obtention du consentement éclairé • c) rendu des résultats • 5°) Le diagnostic anténatal • a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) • b) obtention du consentement éclairé • c) prise en charge de la grossesse en cours • d) rendu des résultats • e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

  35. Consentement de la femme enceinte Elle a eu et compris les informations suivantes Mode de pratique du DPN Nature et limite des examens réalisés Risques liés au prélèvement Délai d’obtention des résultats Remise et explication des résultats Il n’y a en acun cas un engagement à la réalisation d’une interruprion de la grossesse si le fœtus est atteint de la maladie recherchée

  36. 4°) Prescription • a) consultation préalable appropriée • b) obtention du consentement éclairé • c) rendu des résultats • 5°) Le diagnostic anténatal • a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) • b) obtention du consentement éclairé • c) prise en charge de la grossesse en cours • d) rendu des résultats • e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

  37. Utérus Embryon / Foetus Pince Chorion / Placenta CHORIOCENTESE et / ou PLACENTOCENTESE • Date : - Choriocentèse: 10 - 14 SA • - Placento : 15 - 35 SA • Villosités : annexes • Risque :- F.C. 1 à 1,5 % • - erreur 1 % • Intérêt : - gène ++++ • - chs ++ • - enzyme +++

  38. AMNIOCENTESE aiguille utétus • Date: 14 - 30 SA • Cellules Amniotiques • Risque:- F.C. 0,5 % • - erreur 1/10000 • Intérêt: - gène ++ • - chs ++++ • - enzyme +++ • - hormone ++++ fœtus

  39. CORDOCENTESE • Date: 22 - 38 SA • Sang Foetal • Risque:- F.C. 1 % • - erreur 1/1000 • Intérêt: - gène + • - chs +++ • - enzyme ++ aiguille utérus Cordonombilical fœtus

  40. 4°) Prescription • a) consultation préalable appropriée • b) obtention du consentement éclairé • c) rendu des résultats • 5°) Le diagnostic anténatal • a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) • b) obtention du consentement éclairé • c) prise en charge de la grossesse en cours • d) rendu des résultats • e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

  41. 4°) Prescription • a) consultation préalable appropriée • b) obtention du consentement éclairé • c) rendu des résultats • 5°) Le diagnostic anténatal • a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) • b) obtention du consentement éclairé • c) prise en charge de la grossesse en cours • d) rendu des résultats • e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

  42. Diagnostic d’une “maladie d’une particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic” Prise de décision multidisciplinaire Néonatologiste Echographiste Obstétricien Généticien Organisé en Centre de Diagnostic Prénatal

  43. Références : • Génétique moléculaire humaine T. STRACHAN , AP READ, Flammarion Médecine-Sciences (2ème édition française 1998) • Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale, 2004, MASSON • Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale, • http://college-genetique.igh.cnrs.fr/sommaire.html

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