17.1 MARCATORI BIOCHIMICI

2. 17.1 MARCATORI BIOCHIMICI Tabella 17.1 Polimorfismo enzimatico nelle piante da frutto.

3. 17.1 MARCATORI BIOCHIMICI Figura 17.1 Procedura per l’analisi di marcatori enzimatici nelle piante.

4. A B D E C 17.1 MARCATORI BIOCHIMICI Figura 17.2 Marcatori biochimici: (A) fosfo-gluco-mutasi (PGM); (B) lipoossigenasi (LOX) in soia; (C) esterasi (EXT) in poa pratense; (D,E) rappresentazioni schematiche di isoenzimi e alloenzimi del sistema leucinoammino-peptidasi (LAP) e perossidasi (POX) in mais che mettono in evidenza la tessuto-specificità di questi marcatori.

5. A B C 17.1 MARCATORI BIOCHIMICI Figura 17.3 Rappresentazione schematica delle possibili combinazioni di catene polipeptidiche e di profili elettroforetici ottenibili con enzimi monomerici (A), dimerici (B) e tetramerici (C) in organismi diploidi.

6. 17.2 MARCATORI MOLECOLARI: DEFINIZIONE E CLASSIFICAZIONI Figura 17.4 Schema sinottico delle principali classi di marcatori molecolari utilizzabili per l’analisi del genoma. La classificazione adottata si basa sulla tecnica utilizzata (SBH, Southern Blot Hybridization o PCR, Polymerase Chain Reaction) e sul numero di loci saggiati (singolo-locus o multi-locus).

7. Figura 17.5 Spiegazione della natura dominante dei marcatori multi-locus PCR-derivati e della natura codominante degli RFLP con sonde locus-specifiche (  primer; — sonda; enzima di restrizione). 17.2 MARCATORI MOLECOLARI: DEFINIZIONE E CLASSIFICAZIONI

8. 17.2 MARCATORI MOLECOLARI: DEFINIZIONE E CLASSIFICAZIONI Tabella 17.2 Capacità di risoluzione dei gel di agarosio e poliacrilammide in funzione della concentrazione di polimero.

9. Gel di agarosio orizzontale Gel di poliacrilammide verticale Colorazione con bromuro di etidio Colorazione con nitrato di argento 17.2 MARCATORI MOLECOLARI: DEFINIZIONE E CLASSIFICAZIONI Figura 17.6 Rappresentazione schematica di un sistema elettroforetico orizzontale con gel di agarosio (A) e di uno verticale per gel di poliacrilammide (B).

10. 17.3 MAPPE DI RESTRIZIONE Figura 17.7 Mappatura di restrizione di un frammento di DNA di 3 kb clonato in un plasmide.

11. B A 17.3 MAPPE DI RESTRIZIONE Figura 17.8 Mappe dei siti di restrizione identificati nella regione codificante di un gene con informazioni relative agli enzimi di restrizione e alla dimensione dei frammenti di restrizione (A) oppure alla posizione e alla composizione delle sequenze di restrizione (B).

12. Estrazione di DNA genomico Digestione con di enzimi di restrizione Separazione mediante elettroforesi Trasferimento su membrana Ibridazione con sonda marcata Esposizione su lastra radiografica 17.4 IBRIDAZIONE TIPO SOUTHERN BLOT (SBH) Figura 17.9 Procedura di Southern Blot Hybridization.

13. A B 17.4 IBRIDAZIONE TIPO SOUTHERN BLOT (SBH) Figura 17.10 Risultati di una analisi elettroforetica di sei campioni di DNA genomico di Medicago sativa integri e digeriti con tre diversi enzimi di restrizione (HindIII, BamHI e EcoRI) (A) e ibridati con una sonda specifica per una β-tubulina (B).

14. 17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Figura 17.11 Schema di PCR: ogni ciclo prevede la denaturazione del DNA stampo, l’ibridazione dei primer e la polimerizzazione dei nuovi filamenti.

15. A B C 17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Figura 17.12 Numero delle molecole di DNA sintetizzate in relazione al numero di cicli di PCR (A); rappresentazione schematica dell’amplificazione di una molecola di DNA (B) e grafico che mostra l’incremento della quantità di DNA (C).

16. 17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Tabella 17.3 Relazione tra efficienza (E) di PCR e numero di copie.

17. 17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Figura 17.13 Risultato dell’analisi elettroforetica di prodotti di amplificazione originati mediante PCR con primer specifici per un determinato gene (M = marcatori di peso molecolare).

18. 17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Tabella 17.4 Nomenclatura usata per le degenerazioni.

19. 17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE MARCATORI RFLP Figura 17.14 Procedura per l’analisi di marcatori RFLP.

20. 17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE MARCATORI RFLP Figura 17.15 (A) Natura del polimorfismo RFLP; (B) natura del polimorfismo VNTR.

21. A B C 17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE MARCATORI RFLP Figura 17.16 Esempi di profili RFLP Ottenuti con sonde singolo-locus in una popolazione segregante (A, B) e con sonda multi-locus (C).

22. 17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE MARCATORI RFLP Figura 17.17 Esempi di polimorfismi VNTR dovuti alla successione di un numero variabile di elementi ripetuti compresi tra due siti di restrizione.

23. 17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE METODI DI MARCATURA DI SONDE E PRIMER Figura 17.18 Marcatura radioattiva del DNA mediante nick translation (A), random priming (B) e procedura di DIG labeling (C).

24. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI RAPD e AP-PCR Figura 17.19 Analisi di marcatori RAPD con primer decamerici (10-mer) casuali.

25. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI RAPD e AP-PCR Figura 17.20 Rappresentazione schematica della natura del polimorfismo multi-locus dei marcatori RAPD (o AP-PCR).

26. A B C D 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI RAPD e AP-PCR Figura 17.21 Esempi di profili RAPD: A) landrace di radicchio (primer OPA1); B) popolazione segregante di mais (primer OP-B20); C) linea inbred di mais (primer OP-C7); D) landrace di radicchio (primer M13).

27. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SSR Tabella 17.5 Elenco di SSR analizzati nelle piante.

28. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SSR Figura 17.22 Confronto tra regioni di 50 kb appartenenti ai genomi di mais, uomo, lievito e E. coli (modificata da: T.A. Brown 1999).

29. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SSR Tabella 17.6 Frequenza e distribuzione di microsatelliti nei genomi di alcune piante.

30. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SSR Figura 17.23 Analisi dei marcatori microsatelliti (SSR).

31. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SSR Figura 17.24 Strategia per il clonaggio di SSR mediante costruzione e screening di una libreria genomica.

32. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SSR Figura 17.25 Strategia per il clonaggio di SSR mediante amplificazione di frammenti di restrizione con primer Inter-SSR in combinazione con primer AFLP.

33. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SSR Figura 17.26 (A) Natura del polimorfismo SSR: i modelli di bande al locus microsatellite sono diversi a seconda della situazione allelica: l’individuo eterozigote a/b mostra due bande mentre quelli omozigoti a/a e b/b soltanto una. (B) Natura del polimorfismo Inter-SSR con primer ancorati in 5' oppure in 3'.

34. A C E B D 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SSR Figura 17.27 Esempi di profili SSR in 15 cultivar di vite (A) originatesi per ibridazione tra Pinot nero (P) e Gouais bianco (G) e in oltre 60 piante appartenenti ad una popolazione locale di mais (Marano) (B). Esempi di profili SSR radioattivi e fluoresceinati (C, D). Rilevazioni di alleli microsatelliti in genotipi omozigoti ed eterozigoti mediante analisi di frammenti con sequenziatore (E).

35. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI I-SSR Figura 17.28 Analisi di marcatori Inter-SSR (N=basi selettive).

36. A B 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI I-SSR Figura 17.29 Esempi di profili elettroforetici prodotti da marcatori Inter-SSR in popolazioni locali di mais (A) e radicchio (B).

37. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI AFLP Figura 17.30 Procedura per la rilevazione di marcatori AFLP comprendente la digestione del DNA con due distinti enzimi di restrizione, la ligazione di adattatori, la pre-amplificazione e l’amplificazione finale con primer aventi una o più basi selettive.

38. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI AFLP Figura 17.31 Marcatori AFLP fluoresceinati: polimorfismi genomici ottenuti usando diverse combinazioni di enzimi di restrizione/primer con due o più basi selettive ciascuno (foto: S. Ancillotti).

39. A B 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI AFLP Figura 17.32 Marcatori AFLP radioattivi: (A) prova di primer condotta con combinazioni Eco/Mse aventi tre basi selettive usando DNA genomico di poa pratense (P) ed erba medica (M); (B) alleli marcatori AFLP segreganti in una popolazione sperimentale di mais.

40. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI M-SAP Figura 17.33 Tecnica M-SAP: attività degli enzimi HpaII e MspI in relazione alla metilazione di entrambi oppure di uno soltanto dei filamenti.

41. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SAMPL e M-AFLP Figura 17.34 Analisi di marcatori SAMPL (A), di marcatori M-AFLP (B) e di marcatori S-SAP (C).

42. A C B D 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SAMPL e M-AFLP Figura 17.35 Esempi di profili SAMPL (A) generati in una popolazione segregante di Medicago sativa con la combinazione di primer As1/Mse+AAC e di Microsatelliti-AFLP in Poa pratensis ottenuti usando le combinazioni di primer Eco+CCA/CGCAA(CA)9 (B) e Eco+CAC/GCCAC(GCT)6 (C); esempi di profili S-SAP (D) generati in una popolazione segregante di Medicago sativa con il primer LTR-derivato Ret1 (5'-CGGTTTTGTGGGGTTGTGTTAGGCCA-3') in combinazione con il primer Mse+ATC (foto: E. Albertini).

43. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI S-SAP Figura 17.36 Esempi di profili TRAP: i prodotti di amplificazione sono stati ottenuti usando un primer AFLP (Eco+1 oppure Pst+1) in combinazione con un primer degenerato disegnato in una regione conservata (dominio) di famiglie multigeniche (CDK, cicline, fattori delle auxine, MADS box, tubuline, LRR) (foto: G. Galla).

44. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI STS Figura 17.37 Procedura per lo sviluppo di marcatori SCAR e CAPS. Esempi di profili elettroforetici generati da marcatori SCAR e CAPS.

45. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI STS Figura 17.38 Tecnica di PCR inversa (inverse PCR).

46. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) INDICI INFORMATIVI DI POLIMORFISMO Tabella 17.7 Valori di MI e AI in erba medica (Medicago spp.), soia (Glycine max) e mais (Zea mays).

47. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SNP Figura 17.39 Concetto di SNP: allineamento multiplo di sequenze che mostrano polimorfismo dovuto a singoli nucleotidi.

48. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SNP Figura 17.40 Rappresentazione grafica di un aplotipo molecolare basato su marcatori SNP.

49. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SNP Tabella 17.8 Ripetizioni mononucleotidiche del genoma cloroplastico di alcune specie vegetali.

50. 17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI) MARCATORI SNP Figura 17.41 Analisi SNP del genoma cloroplastico: (A) esempi di polimorfismi visualizzati mediante elettroforesi; (B) allineamento di sequenze con polimorfismi a carico di motivi mononucleotidici.