Metodi di studio
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Metodi di studio. Il primo microscopio ottico Un microscopio semplice Hooke, 1665. Un moderno microscopio. Microscopi ottici da esercitazione. Fotocamera o telecamera. Oculari. Revolver con obiettivi. Stativo. Tavolino traslatore. Fonte di illuminazione. Condensatore. Diaframma di campo.

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Presentation Transcript

Il primo microscopio ottico un microscopio semplice hooke 1665
Il primo microscopio otticoUn microscopio sempliceHooke, 1665




Anatomia di un microscopio

Fotocamera o telecamera

Oculari

Revolver con obiettivi

Stativo

Tavolino traslatore

Fonte di illuminazione

Condensatore

Diaframma di campo

Vite macrometrica e micrometrica

Anatomia di un microscopio






Microscopia ottica1
Microscopia Ottica

OSSERVAZIONI A FRESCO

  • Prime osservazioni

    • Il preparato si deteriora velocemente

  • Poco informative

    • Descrizioni brevi ed inesatte


Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata
Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata

Su un vetrino porta-oggetto si pone una goccia di acqua o soluzione fisiologica

Il materiale da osservare viene posto sulla goccia ed osservato


Preparati in campo chiaro
Preparati in campo chiaro

Un batterio

Campo chiaro, 1000x

Cellule


Microscopia ottica a contrasto di fase
Microscopia Otticaa Contrasto di fase

  • Gli oggetti visti in campo chiaro hanno poco contrasto

    • Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante

      • Applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte nell’obiettivo

    • Iraggi luminosi che sono stati modificati generano fenomeni di interferenza che rendono più chiari o più scuri gli oggetti illuminati


Microscopia ottica a contrasto di fase1

Permette, tramite sistema di lenti di osservare le cellule a fresco

Le varie parti della cellula appaiono come strutture con diverse tonalità di grigio

Microscopia Ottica a Contrasto di fase


Un batterio fresco

400x

Un lievito

(S. cerevisiae)

400x

Una muffa

(G. candidum)

400x


Osservazione in campo scuro

Un particolare tipo di condensatore nell’osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato.

Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro.

In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico

Osservazione in campo scuro


Osservazione in campo scuro1
Osservazione in campo scuro campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato.


Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati
Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato.

  • Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio

    Coloranti vitali

    Le cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento

    Oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente specie diverse o strutture cellulari diverse

    Coloranti che richiedono fissazione

    Le cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule


Preparazione di un campione biologico per la microscopia ottica
Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica

  • Acquisizionedel campione e taglio in pezzi (1cm3)

    • Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem

    • Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi)


  • Fissaggio Otticadel campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare)

    • Generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide)

    • Cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine

    • Si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli"

    • Deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi persenti degradino il tessuto


  • Disidratazione Otticadel campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo

    • Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non è solubile in H2O

  • Eliminazionedell'etanolo e passaggi in xilene

    • Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo


  • Inclusione Otticadel campione in in mezzo appropriato paraffina o resina

    • Tessuti sono "molli" e fragili

    • Diversi passaggi in paraffina calda

    • La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H2O

    • La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione


Sezione non colorata Ottica

Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 mm

Montaggiodelle sezioni su vetrini per microscopia


Colorazione automatizzata Ottica

Colorazionedelle sezioni con il metodo più appropriato

I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo


Colorazioni
Colorazioni Ottica

  • Colorazione

    • Con un colore brillante di certe componenti del tessuto

  • Contro colorazione

    • Del resto del tessuto con un colore contrastante


Ematossilina eosina
Ematossilina/Eosina Ottica

  • Ematossilina

    • Ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine)

  • Eosina

    • Ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol)


Perch questa slide blu
Perchè questa "slide" è blu … Ottica

  • Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila

  • È colorata dall'ematossilina

  • Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili


E questa rossa
… e questa rossa ? Ottica

  • Se una porzione si colora in rosso /arancio/rosa, viene detta acidofila o eosinofila

  • È colorata dall'eosina

  • Sono le proteine del citosol


Altre colorazioni

Le aree bianche sono lipidi Ottica

Altre colorazioni

  • PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff)

    • Per sostanze ricche in zuccheri (muco)

  • Tricromica o Hazan-Mallory

    • Per i tessuti connettivi

    • Le fibre si colorano in blu

      • Con E&E sono rosa

Adiposo Bianco


Mielina Ottica

Cellule nervose

Cellule del sangue

  • Osmio o Sudan black

    • Per grasso/lipidi/mielina

    • I lipidi non incorporano coloranti acquosi

  • Argento ed oro

    • Per fibre delicate e processi cellulari

  • Giemsa

    • Per le cellule del sangue

    • Simile ad E&E


E le aree bianche
E le aree "bianche"? Ottica

  • I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E

    • Sangue, linfa etc.

  • Si riconoscono come ampi spazi bianchi

  • Anche i lipidi ed il grasso non si colorano

Mesenchima


Interpretate il campione
Interpretate il campione !!! Ottica

  • Dovete pensare in3 dimensioni

  • Sezioni serialisono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione



Artefatti
OtticaArtefatti”

  • Shrinkage

    • Lascia dello spazio aggiuntivo

    • Disidratazione e fissaggio

  • Fratture al piano di taglio

    • Tagli netti e ben visibili

    • Lama deteriorata


  • Colorante precipitato Ottica

    • Macchie di colore a "grano di pepe”

  • Tessuto "pinzato"

    • Strumento per l'excisione deteriorato

    • Durante o dopo il sezionamento

  • Pieghe

    • Durante il montaggio



Microscopia elettronica a trasmissione
Microscopia Elettronica a Trasmissione Ottica

  • Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta

    • Alta risoluzione

  • Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi

  • Gli elettroni passano attraverso il campione


La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico

Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm

Risoluzione del MO:

200 nm = 2,000 Angstroms

Risoluzione del TEM:

2 Angstroms

1 mm = 1000 µm

1 µm = 1000 nm

1 nm = 10 Angstroms

Pinocitosi


Preparazione di campioni biologici per tem
Preparazione di Campioni Biologici per TEM strutture non visibili con il microscopio ottico

  • Acquisizionedel campione e taglio in pezzi (1cm3)

  • Fissaggiodel campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio

    • L’osmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)

    • Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari


Disidratazione strutture non visibili con il microscopio ottico dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo

Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina

Taglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro)

La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm

Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm)


Montaggio strutture non visibili con il microscopio otticodelle sezioni su di una griglia

Colorazione delle sezionicon nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo

Visualizzazioneal TEM

Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini


Freeze fracture
Freeze-fracture strutture non visibili con il microscopio ottico

  • Il tessuto prelevato viene congelato a -140/150 °C

  • Con un martelletto viene provocata la frattura, secondo le linee di forza del tessuto

  • Evaporazione e deposizione di metalli pesanti

  • Eliminazione materia organica


Autoradiografia
Autoradiografia strutture non visibili con il microscopio ottico

Utilizzando isotopi radioattivi si possono marcare strutture cellulari ben definite e visualizzarle poi tramite microscopia ottica od elettronica


Ottico Elettronico strutture non visibili con il microscopio ottico


Microscopia elettronica a scansione
Microscopia Elettronica a Scansione strutture non visibili con il microscopio ottico

SEM fa una scansione della superfice del campione

Produce immagini 3-D


Preparazione dei campioni per sem
Preparazione dei campioni per SEM strutture non visibili con il microscopio ottico

  • Acquisizione del campione

    • Trattandolo con cura in modo da non danneggiare la superficie

  • Fissazione e disidratazione

  • Non si include


  • Poggiato su di un supporto e ricoperto con un metallo strutture non visibili con il microscopio ottico

    • Oro, cromo, palladio, carbone

    • Deve essere elettron-conducente (non elettrondenso)

  • Visualizzato al microscopio

  • Fotografato

  • Si possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi X


Microscopia a fluorescenza
Microscopia a Fluorescenza strutture non visibili con il microscopio ottico

  • Il campione viene colorato con anticorpi oppure sostanze specifiche coniugate con fluorocromi

  • La luce utilizzata ha lunghezze d’onda specifiche per eccitare i fluorocromi

  • I fluorocromi emettono radiazione blu, rossa o verde


Microscopia a fluorescenza1
Microscopia a Fluorescenza strutture non visibili con il microscopio ottico


Microscopia confocale

  • La luce monocromatica, di lunghezza d’onda breve, è emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze d’onda

  • Le lenti dell’obbiettivo focalizzano la luce in un punto del piano ottico del campione

  • I fluorocromi usati per colorare vengono eccitati ed emettono a lunghezza d’onda maggiore, in grado di attraversare lo specchio e focalizzarsi nel piano del diaframma

  • Il foto-moltiplicatore amplifica l’intensità del segnale e lo trasmette al computer che elabora l’immagine

  • La luce che proviene dai piani superiori o inferiori al piano focale non passa attraverso il diaframma e non contribuisce alla formazione dell’immagine

  • Diversi punti dello stesso piano e dei paini consecutivi vengono illuminati e registrati mediante la scansione col laser

Microscopia Confocale


Metodi analitici
Metodi analitici emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze d’onda

  • Come si analizzano gli organelli o la struttura fine?

    • Metodiche che permettono l’isolamento dei componenti cellulari intatti

  • Centrifugazione, semplice o differenziale

    • Permette l’isolamento sia delle cellule da un tessuto sia delle singole componenti cellulari


Centrifugazione
Centrifugazione emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze d’onda


Centrifugazione differenziale
Centrifugazione differenziale emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze d’onda


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