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Metodi di studio

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Metodi di studio. Il primo microscopio ottico Un microscopio semplice Hooke, 1665. Un moderno microscopio. Microscopi ottici da esercitazione. Fotocamera o telecamera. Oculari. Revolver con obiettivi. Stativo. Tavolino traslatore. Fonte di illuminazione. Condensatore. Diaframma di campo.

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Presentation Transcript
anatomia di un microscopio

Fotocamera o telecamera

Oculari

Revolver con obiettivi

Stativo

Tavolino traslatore

Fonte di illuminazione

Condensatore

Diaframma di campo

Vite macrometrica e micrometrica

Anatomia di un microscopio
microscopia ottica1
Microscopia Ottica

OSSERVAZIONI A FRESCO

  • Prime osservazioni
    • Il preparato si deteriora velocemente
  • Poco informative
    • Descrizioni brevi ed inesatte
preparati in campo chiaro a goccia schiacciata
Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata

Su un vetrino porta-oggetto si pone una goccia di acqua o soluzione fisiologica

Il materiale da osservare viene posto sulla goccia ed osservato

preparati in campo chiaro
Preparati in campo chiaro

Un batterio

Campo chiaro, 1000x

Cellule

microscopia ottica a contrasto di fase
Microscopia Otticaa Contrasto di fase
  • Gli oggetti visti in campo chiaro hanno poco contrasto
    • Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante
      • Applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte nell’obiettivo
    • Iraggi luminosi che sono stati modificati generano fenomeni di interferenza che rendono più chiari o più scuri gli oggetti illuminati
microscopia ottica a contrasto di fase1

Permette, tramite sistema di lenti di osservare le cellule a fresco

Le varie parti della cellula appaiono come strutture con diverse tonalità di grigio

Microscopia Ottica a Contrasto di fase
slide16

Un batterio

400x

Un lievito

(S. cerevisiae)

400x

Una muffa

(G. candidum)

400x

osservazione in campo scuro

Un particolare tipo di condensatore nell’osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato.

Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro.

In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico

Osservazione in campo scuro
uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati
Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati
  • Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio

Coloranti vitali

Le cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento

Oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente specie diverse o strutture cellulari diverse

Coloranti che richiedono fissazione

Le cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule

preparazione di un campione biologico per la microscopia ottica
Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica
  • Acquisizionedel campione e taglio in pezzi (1cm3)
    • Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem
    • Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi)
slide21
Fissaggiodel campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare)
    • Generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide)
    • Cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine
    • Si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli"
    • Deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi persenti degradino il tessuto
slide22
Disidratazionedel campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo
    • Paraffina (materiale usato per l\'inclusione) non è solubile in H2O
  • Eliminazionedell\'etanolo e passaggi in xilene
    • Paraffina non è solubile nemmeno nell\'etanolo
slide23
Inclusionedel campione in in mezzo appropriato paraffina o resina
    • Tessuti sono "molli" e fragili
    • Diversi passaggi in paraffina calda
    • La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall\'H2O
    • La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione
slide24

Sezione non colorata

Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 mm

Montaggiodelle sezioni su vetrini per microscopia

slide25

Colorazione automatizzata

Colorazionedelle sezioni con il metodo più appropriato

I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo

colorazioni
Colorazioni
  • Colorazione
    • Con un colore brillante di certe componenti del tessuto
  • Contro colorazione
    • Del resto del tessuto con un colore contrastante
ematossilina eosina
Ematossilina/Eosina
  • Ematossilina
    • Ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine)
  • Eosina
    • Ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol)
perch questa slide blu
Perchè questa "slide" è blu …
  • Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila
  • È colorata dall\'ematossilina
  • Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili
e questa rossa
… e questa rossa ?
  • Se una porzione si colora in rosso /arancio/rosa, viene detta acidofila o eosinofila
  • È colorata dall\'eosina
  • Sono le proteine del citosol
altre colorazioni

Le aree bianche sono lipidi

Altre colorazioni
  • PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff)
    • Per sostanze ricche in zuccheri (muco)
  • Tricromica o Hazan-Mallory
    • Per i tessuti connettivi
    • Le fibre si colorano in blu
      • Con E&E sono rosa

Adiposo Bianco

slide31

Mielina

Cellule nervose

Cellule del sangue

  • Osmio o Sudan black
    • Per grasso/lipidi/mielina
    • I lipidi non incorporano coloranti acquosi
  • Argento ed oro
    • Per fibre delicate e processi cellulari
  • Giemsa
    • Per le cellule del sangue
    • Simile ad E&E
e le aree bianche
E le aree "bianche"?
  • I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E
    • Sangue, linfa etc.
  • Si riconoscono come ampi spazi bianchi
  • Anche i lipidi ed il grasso non si colorano

Mesenchima

interpretate il campione
Interpretate il campione !!!
  • Dovete pensare in3 dimensioni
  • Sezioni serialisono l\'ideale per l\'interpretazione e la ricostruzione
artefatti
“Artefatti”
  • Shrinkage
    • Lascia dello spazio aggiuntivo
    • Disidratazione e fissaggio
  • Fratture al piano di taglio
    • Tagli netti e ben visibili
    • Lama deteriorata
slide36
Colorante precipitato
    • Macchie di colore a "grano di pepe”
  • Tessuto "pinzato"
    • Strumento per l\'excisione deteriorato
    • Durante o dopo il sezionamento
  • Pieghe
    • Durante il montaggio
microscopia elettronica a trasmissione
Microscopia Elettronica a Trasmissione
  • Elettroni hanno una lunghezza d\'onda corta
    • Alta risoluzione
  • Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi
  • Gli elettroni passano attraverso il campione
slide41

La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico

Risoluzione dell\'occhio: 0.2 mm = 200 µm

Risoluzione del MO:

200 nm = 2,000 Angstroms

Risoluzione del TEM:

2 Angstroms

1 mm = 1000 µm

1 µm = 1000 nm

1 nm = 10 Angstroms

Pinocitosi

preparazione di campioni biologici per tem
Preparazione di Campioni Biologici per TEM
  • Acquisizionedel campione e taglio in pezzi (1cm3)
  • Fissaggiodel campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio
    • L’osmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)
    • Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari
slide43
Disidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo

Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina

Taglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro)

La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm

Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm)

slide44
Montaggiodelle sezioni su di una griglia

Colorazione delle sezionicon nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo

Visualizzazioneal TEM

Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

freeze fracture
Freeze-fracture
  • Il tessuto prelevato viene congelato a -140/150 °C
  • Con un martelletto viene provocata la frattura, secondo le linee di forza del tessuto
  • Evaporazione e deposizione di metalli pesanti
  • Eliminazione materia organica
autoradiografia
Autoradiografia

Utilizzando isotopi radioattivi si possono marcare strutture cellulari ben definite e visualizzarle poi tramite microscopia ottica od elettronica

microscopia elettronica a scansione
Microscopia Elettronica a Scansione

SEM fa una scansione della superfice del campione

Produce immagini 3-D

preparazione dei campioni per sem
Preparazione dei campioni per SEM
  • Acquisizione del campione
    • Trattandolo con cura in modo da non danneggiare la superficie
  • Fissazione e disidratazione
  • Non si include
slide54
Poggiato su di un supporto e ricoperto con un metallo
    • Oro, cromo, palladio, carbone
    • Deve essere elettron-conducente (non elettrondenso)
  • Visualizzato al microscopio
  • Fotografato
  • Si possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi X
microscopia a fluorescenza
Microscopia a Fluorescenza
  • Il campione viene colorato con anticorpi oppure sostanze specifiche coniugate con fluorocromi
  • La luce utilizzata ha lunghezze d’onda specifiche per eccitare i fluorocromi
  • I fluorocromi emettono radiazione blu, rossa o verde
microscopia confocale

La luce monocromatica, di lunghezza d’onda breve, è emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze d’onda

  • Le lenti dell’obbiettivo focalizzano la luce in un punto del piano ottico del campione
  • I fluorocromi usati per colorare vengono eccitati ed emettono a lunghezza d’onda maggiore, in grado di attraversare lo specchio e focalizzarsi nel piano del diaframma
  • Il foto-moltiplicatore amplifica l’intensità del segnale e lo trasmette al computer che elabora l’immagine
  • La luce che proviene dai piani superiori o inferiori al piano focale non passa attraverso il diaframma e non contribuisce alla formazione dell’immagine
  • Diversi punti dello stesso piano e dei paini consecutivi vengono illuminati e registrati mediante la scansione col laser
Microscopia Confocale
metodi analitici
Metodi analitici
  • Come si analizzano gli organelli o la struttura fine?
    • Metodiche che permettono l’isolamento dei componenti cellulari intatti
  • Centrifugazione, semplice o differenziale
    • Permette l’isolamento sia delle cellule da un tessuto sia delle singole componenti cellulari
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