ميكروسكوپ ( Microscope )

2. ميكروسكوپ (Microscope) میکروسکوپ به معنی کپی یا ثبت ذره كوچك است و ریشه در زبان لاتین دارد میکروسکوپ دستگاهی است که برای دیدن اجسام خیلی کوچک بکار می‌رود و می‌توانتصویری بسیار بزرگتر و با جزئیات بیشتر از جسم مورد نظر ، بدست آورد. میکروسکوپ شامل دو دستگاه عدسی همگرا است که ممکن است هر کدام ترکیبی از چند عدسی باشد، ولی مانند یک عدسی همگرا عمل می‌کند، یکی عدسی شیئی یا ابژکتیو و دیگری عدسی چشمی یا اکولر نام دارد. لیونهاک یکی از اولین مخترعینميكروسكوپ در قرن هفده ميلادي بود او مشاهدات خود را در زیر میکروسکوپ خود ثبت و یادداشتهای دقیقی تهیه نمود. در موزه میلدبرگ در هلند یکی از میکروسکوپ های اولیه نگاهداری می شود که احتمالا بوسیله این دانشمند ساخته شده است

3. اجزا يك ميكروسكوپ 1- بدنه 2- منبع نور 3- كندانسور 4- صفحه نمونه 5- ماكرومتر و ميكرومتر 6- عدسي شيي 7- عسي چشمي

4. موارد استفاده از میکروسکوپ امروزه وجود ميكروسكپ در هر آزمايشگاه آموزشي و درماني ضروري است . در آزمايشگاه تشخيص طبي ميكروسكوپ جهت بررسي انواع ميكروب ها و انگل ها در مايعات بدن ، انواع سلولهاي خوني و غيره استفاده مي شود . همچنين دربرخي از آزمايشهاي تخصصي و تحقيقاتي نياز به ميكروسكپ هاي تخصصي مانند: ميكروسپ فلوروسنت (Fluorescent Microscope)، ميكروسكپ الكتروني (Electron Microscopy) ، ميكروسكپ زمينه سياه (Dark field) ميكروسكپ اينورت (Inverted Microscope)و… است حتی جراحها از میکروسکوپ ویژه ای برای اعمال ظریف جراحی (جراحی گوش و چشم و ...) استفاده می کنند.

5. از میکروسکوپ در آزمایشگاهها درباره موضوعات گوناگون از گیاه شناسی گرفته تا فلزشناسی برای مطالعه استفاده می گردد. بزرگنمايي ميكروسكوپ = بزرگنمايي عدسي شيي * بزرگنمايي عدسي چشمي

10. ميکروسکوپ برای حفظ کيفيت عملکرد ميکروسکوپ آگاهی از نحوه صحيح نگهداری آن از اهميت ويژه ای برخوردار می باشد که در زير به نکاتی در اين مورد اشاره می شود: 1- هنگامی که از ميکروسکوپ استفاده نمی‌شود، لامپ آن خاموش و با روکش مناسب پوشانده شود. 2- بلافاصله پس از استفاده، روغن ايمرسيون از روی عدسی‌های شيئی پاک شود. 3- قبل و بعد از استفاده از ميکروسکوپ، قسمتهای نوری با دستمال مخصوص لنز ،کاغذهای جاذب يا پارچه نرم آغشته به محلولی متشکل از يک حجم اتر و يک حجم ايزوپروپيل الکل، پاک شود. 4- برای پاک کردن لنزها نبايد از گزيلل استفاده شود. لنزها نمی‌بايست در الکل خيسانده شوند.

11. 5- در حال مشاهده لام ، برای وضوح تصوير ، هيچگاه عدسی‌های شيئی را خيلی پائين نبريد زيرا ممکن است منجر به خراشيدگی اسلايد و صدمه به لنز شود. 6- عدسی‌های شيئی نبايد از ميکروسکوپ جدا شوند. 7- در هوای گرم و مرطوب به منظور جلوگيری از رشد قارچ بر روی لنزها ، می‌توان ميکروسکوپ را هر عصر در محفظه‌ای که با يک يا دو لامپ 40 وات گرم شده و محيط خشکی فراهم آورده ، قرار داد. بايد توجه داشت دمای آن محفظه نمی‌بايست بيش از 5 درجه از دمای آزمايشگاه بالاتر باشد. 8- در هوای گرم و خشک که مشکل اصلی گرد و غبار است ، علاوه بر پوشاندن ميکروسکوپ در ساعات غير کاری، در پايان روز می‌بايست گرد و غبار لنزها را با دميدن هوا از وسيله‌ای مانند پوار يا با استفاده از برس مخصوص لنز يا قلم موی نقاشی و در صورت لزوم کاغذ مخصوص لنز(Lense paper) تميز نمود.

12. اسپكتروفتومتر(Spectrophotometer) اسپكتروفتومتر ياطيف سنج يك دستگاه آزمايشگاهي اوليه است كه جهت خواندن نتايج آزمايش هایي كه واكنش آنها از نوع End point هستند بكارمي روداين دستگاه ميزان جذب يا عبور طول موجهاي مشخصي از انرژي تابشي (نور) از يك محلول را اندازه گيري مينمايد بيشترين كاربرد آن در آزمايشگاه در بخش بيوشيمي است. اساس كار اسپكتروفتومتر همانند بسيار از دستگاههاي آزمايشگاهي، براندازه گيري ميزان نور جذب شده توسط يك محلول رنگي است كه طبق قانون بير-لامبرت (-Lambert LawBear)ميزان جذب نور(OD)متناسب با غلظت ماده حل شده در محلول است. قانون بير-لامبرت زماني صادق است كه: 1- نور منتشر شده بر روي ماده مورد نظر تك رنگ باشد 2-غلظت ماده حل شده بايد در محدوده خطي باشد

13. 3- جذب حلال در مقایسه با ماده حل شده ناچیز باشد. 4- واکنش شیمیایی دیگری بین ماده مورد نظر و سایر مواد موجود در محلول صورت نگیرد. 5- محدوده ای از طول موج انتخاب گردد که در آن بیشترین جذب حاصل شود.

14. اسپكتروفتومترهاي مرئي و فرابنفش رايجترين ، نوع آنها در مراكز تشخيصي و آزمايشگاهي است اسپكتروفتومترها بر اساس تعداد پرتوهاي نوري كه به آشكارساز دستگاه مي رسد به دو نوع تك پرتويي و دوپرتويي تقسيم ميشوند. در نوع تك پرتويي يك جايگاه براي محلول و بلانگ وجود دارد در دستگاههاي دو پرتويي دو جايگاه منظور شده است .پرتوتابش شده بطور خودكار مجزا شده و ازمحلول بلانك و نمونه همزمان عبور مي كند اين دستگاهها بسيار حساس مي باشند.

15. قسمتهاي مختلف يك اسپكتروفتومتر شامل: 1ـ منبع نور(Light Source) 2ـ تك رنگ ساز(Monochromator) 3ـ شكاف عبور يا متمركز كننده پرتو(Focusing Device) 4ـ كووت يا محل قرار دادن نمونه (Cuvet) 5ـ دتكتوريا آشكار ساز (Detector) 6ـ صفحه نمايشگر (Display device)

17. منبع نور(Light Source) معمولا“از لامپهاي تنگستني كه توليد نور با طول موج990-300 نانومتر مينمايند استفاده مي شود براي توليد پرتوهاي فرابنفش غالبا“ از از لامپ هاي هيدروژني يا دوتريومي (با طول موج 450-200نانومتر) استفاده مي شود لامپ هاي دوتريومي معمولا“ پايدارترند وطول عمر بيشتري دارند.

18. تك رنگ ساز(Monochromator) اين قسمت دستگاه، نور مخلوط را به پرتوهاي تك رنگ تجزيه مي كند اين عمل در اسكپتوفتومتر معمولا“ توسط منشور يا سيستم گريتينگ(Grating) انجام مي گيرد

19. شكاف عبور يا متمركز كننده پرتو(Focusing Device) تركيبي از عدسي ها،آئينه هاي كوچك مي باشد كه فقط به طيف رنگي با طول موج مورد نظر اجازه عبور مي دهند هر قدر عرض شكاف نور كمتر باشد كيفيت پرتوها بهتر خواهد بود. ميزان منوكروماتيك بودن نور تابيده شده به كووت بسيار مهم مي باشد كه با (Spectral Band Width) SBWپهناي باند طيف برحسب نانومتر مشخص مي شود هرچقدر عدد SBW كوچكتر باشد كيفيت دستگاه بهتر خواهد بود كه بستگي به نوع گريتينگ و پهناي شكاف عبور نور دارد. بهترين SBW براي اسپكتروفتومتر هاي آزمايشگاهي 8 نانومتر و براي دستگاههاي تحقيقاتي 4-8/1نانومتر مي باشد

20. كووت يا محل قرار دادن نمونه (Cuvet) كووتها محفظه هاي شفافي هستند كه محلول موردآزمايش در آن ريخته شده و در جايگاه خاص خود كه در مسير نور تكرنگ تعبيه شده است قرار مي گيرد. كووتها با توجه به نوع مصرف جنس ، شكل و حجم متفاوتي دارند. براي محلولهاي اسيدي و قليايي از كووتهاي مخصوص شيشه اي و براي طول موجهاي زير 320نانومتر از لوله كوارتز يا پلاستيك استفاده مي شود

21. دتكتوريا آشكار ساز (Detector) دتكتور يا آشكار ساز انرژي نوراني (عبور كرده از محلول را) به انرژي الكتريكي تبديل و آن را تقويت مي كند. آشكار سازها معمولا“ به سه گروه تقسيم مي شوند. 1- فتوالكتريكي 2- فتوشيميايي 3- حرارتي در اسپكتروفتومتر از آشكار سازهاي فتوالكتريكي استفاده مي شود . فتوسل و فتوتيوب از جمله آنهاست

22. صفحه نمايشگر (Display device) داده هاي بدست آمده از يك آشكار ساز بوسيله يك دستگاه بازخواني مانند يك گالوانومتر يا اسلوسكپ نشان داده مي شود انواع مختلف نمايشگر در اشكال عقربه اي، ديجيتالي و كامپيوتري در اسپكتروفتومترها وجود دارد.

26. كار با اسپكتروفتومتر 1- پس اتصال به برق دستگاه را روشن مي كنيم حدود 10 دقيقه صبر مي كنيم تا به اصطلاح دستگاه گرم شود 2- طول موج مورد نظر را انتخاب مي كنيم 3- با استفاده بلانك دستگاه را صفر ميكنيم 4-استانداردآزمايش و نمونه به ترتيب به كووت منتقل نموده و OD آن را مي خوانيم 5- با يك محاسبه غلظت نمونه بدست مي آوريم A=ODt/ODs X S

27. فتومتر (Photometer) با توجه به اينكه اسپكتروفتومتر معمولا“ جهت خواندن جذب نوري در واكنش هاي End point كاربرددارد لذا امروز با توجه به افزايش تنوع تستها كاربرد آنها كم شده است و جاي خود را به فتومترها داده اند. بيشتري كاربرد اين دستگاه نيز در بخش بيوشيمي آزمايشگاه است.

28. اساس كار فتومتر اساس كار فتومترهمانند اسپكتروفتومتر است در فتومتر منوكروماتور، فيلترها ي شيشه اي رنگي هستند كه بخش اعظم نور را جذب كرده و فقط طول موجهاي محدودي را عبور مي دهند فتومترهاي پيشرفته در حدود 8 فيلتر رنگي دارند كه معمولا“ شامل طول موج هاي340،405،492،520،546،578،623استكه بسته به نوع آزمايشفيلتر مورد نظر را انتخاب مي كنند

29. منوكروماتور فتومترهایی با فيلترهاي تك رنگ كاملا“ استاندارد بوده و از طرفي بسياري از فتومترهاي نسل جديد تقريبا“ نيمه اتوماتيك مي باشند لذا قسمتي از واكنش در داخلدستگاه انجام ميگيرد و قابل برنامه ريزي جهت خوانش جذب نوري در زمانهاي برنامه ريزي شده مي باشند همچنين آنها داراي انكوباتور37 درجه مي باشند. لذا براي آزمايش هاي آنزيمي كه نياز به خوانش متوالي در زمانهاي معين و 37 درجه دارند(Kinetic) بسيار ضروري مي باشند. بسياري از فتومترها علاوه بر نمايشگرهاي ديجيتالي ، چاپگر نيز دارند. موقع خريد اسپكتروفتومتر و فتومتر بايستي به دامنه طول موج و عدد پهناي باند طيف ها(SBW) آنها توجه شود

30. Rally 5010

34. اسپكتروفتومتر و فتومتر مهمترين مواردي که در اسپكتروفتومترها مورد ارزيابي قرار مي‌گيرند عبارتند از: خطي بودن صحت فتومتريک صحت طول موج رانش نورهای ناخواسته

35. خطي بودن Linearity هدف از اين آزمون تعيين محدوده اي است که در آن ارتباط خطي بين نور جذب شده و خوانش فتومتر وجود دارد. در اين آزمايش ميزان عدم صحت جذب نوري در هر رقت بررسي مي شود. براي اين ارزيابي از محلولهاي مختلفي مي توان استفاده نمود كه مي بايست تا حد امكان پايدار باشند. بعلت تاثير متغيرهايي از قبيل خطاي رقت ، کاهش پايداري ، تغييراتpH و تاثيرات دما در محلولها، بايد در استفاده از اين روش ، عوامل ياد شده را تحت کنترل گرفت. در صورت امکان، استفاده از فيلترهاي شيشه‌اي solid glass filter مانند ديدميوم، جايگزيني براي روش قبل ميباشد ( اين فيلترها از طريق شرکتهاي پشتيبان قابل دستيابي است) 1

36. بررسي خطي بودن با استفاده از محلول در طول موجهاي مختلف : براي بررسي خطي بودن در طول موج 540 نانومتر از محلول HiCN ، در طول موج 405 نانومتر از محلول پارانيتروفنل 0/08ميلي مول در ليتر و در طول موج 340 نانومتر از محلول دي‌كرومات پتاسيم استفاده مي گردد.

37. جهت بررسي خطي بودن طول موج 540 نانومتر مي بايست با مخلوط نمودن خون با درابکين ، ذخيره اي (Stock)از محلول سيان مت هموگلوبين با جذب نوري حدود 2 تهيه شود .( بطور مثال از اضافه کردن 100 ميكروليتر خون با هموگلوبينg/l 170 به 5 ميلي ليتر درابكين ، محلولي با جذب نوري حدود 09/2 بدست مي آيد .) اگر ميزان هموگلوبين نمونه كم باشدحجم بيشتري از خون ، مي بايست به درابكين اضافه شود. سپس از اين محلول ذخيره ، حداقل 4 رقت تهيه مي شود (بطور مثال 1/2، 1/4، 1/8 و1/16) و جذب نوري محلول ذخيره و رقتهاي تهيه شده‌ در طول موج ياد شده در مقابل بلانک درابکين، قرائت مي‌گردد تا 5 خوانده بدست آيد . جذبهاي نوري قرائت شده به عنوان مقدار مشاهده شده (Observed) در نظر گرفته مي‌شود .

38. براي محاسبه ميزان خطا در هر رقت ،جذب نوري(OD) رقتي از محلول که در حدود 0/4باشد به عنوان مبنا انتخاب و ميزان خطاي ساير رقتها با توجه به آن محاسبه مي شود تا جذب مورد انتظار بدست بيايد . بطور مثال اگر جذب نوري نمونه با رقت 1/4، حدود 0/4باشد .جذب نوري مورد انتظار براي رقت 1/2بصورت زير محاسبه مي شود : جذب نوری رقت 0/4 1/4 X 1/2

39. مقدار Xبدست آمده ، مقدار مورد انتظار (Expected ) جذب نوري نمونه در رقت 1/2مي باشد. بدين ترتيب پس از محاسبه جذب نوري مورد انتظار براي رقتهاي مختلف ، ميزان عدم صحت هر رقت با استفاده از فرمول Bias تعيين مي‌گردد .

40. مثال زير ، ميزان عدم صحت جذب نوري رقتهاي مختلف نمونه سيان مت هموگلوبين در يک دستگاه فتومتررا نشان مي دهد .

41. براي بررسي خطي بودن در طول موج 405 نانومتر از محلول پارانيتروفنل 0/08ميلي مول در ليتر استفاده مي‌گردد . طرز تهيه اين محلول: وزن يک مول پارانيتروفنل = 139/11گرم يک ميلي مول =0/13911گرم براي تهيه پارانيتروفنل 0/08ميلي مول در ليتر ، با استفاده از محاسبه زير ، مي بايست 11/11288پارانيتروفنل ( بطور تقريبي 11/1ميلي گرم) در يک ليتر هيدروکسيد سديم (Na OH)0/01نرمال حل شود. 0.13911 × 0.08 = 0.0111288 = گرم 11.11288 ميلي‌گرم ~ 11.1 ميلي‌گرم

42. اين محلول، جذبي در حدود 2 خواهد داشت و با تهيه رقتهاي مختلف در سود(Na OH) 0/01نرمال مي‌توان خطي بودن در محدوده جذب 0.1 تا 2 را در طول موج 405نانومتر و در مقابل بلانک سود، بررسي نمود. بطور مثال با تهيه محلولهايي با غلظت 0.06 ، 0.04 ، 0.02 ، 0.01 و 0.005 ميلي مول در ليتر نتايج زير بدست آمده و Bias محاسبه گرديده است. همانطور که قبلا گفته شد جذب نوري حدود 0.4 را ملاک قرار داده و با تناسب مانند مثال زير جذب نوري مورد انتظار هر غلظت را محاسبه نماييد. جذب نوري غلظت 0.463 0.02x 0.04

44. براي بررسي خطي بودن درطول موج 340نانومتر از محلول دي‌کرومات پتاسيم استفاده مي‌شود. برای تهيه محلول: پودر دي‌کرومات پتاسيم را در oven با حرارت 110 درجه سانتي‌گراد به مدت يکساعت خشک کرده و 200ميلي‌گرم آن را با اسيد سولفوريک 0/01نرمال به حجم 1 ليتر برسانيد. اين محلول را بعنوان ذخيره در شيشه تيره نگهداري نمائيد. محلول ذخيره جذبي در حدود 2 خواهد داشت و با تهيه رقتهاي مختلف در اسيد سولفوريک 0/01نرمال، مي‌توان خطي بودن در محدوده جذب 0.1تا 2را در مقابل بلانک اسيد سولفوريک، درطول موج 340 نانومتر بررسي نمود. بطور مثال با تهيه محلولهايي با غلظت 200 ، 150 ، 100 ، 50 ، 25 و 10ميلي گرم در ليتر نتايج زير بدست آمده و Bias محاسبه گرديده است.

45. مشابه مثال قبل جذب نوري حدود 0.4 را ملاک قرار داده و با تناسب مانند مثال زير جذب نوري مورد انتظار هر غلظت را محاسبه نماييد. جذب نوري غلظت 0.493 50x 25

46. نکته : بررسي صحت فتومتري با استفاده از روش گفته شده براي فتومتر امکانپذير نمي‌باشد(بعلت عدم دسترسي به طول موج 350 نانومتر ). اين بررسي مي‌بايست با استفاده از محلولها يا فيلترهاي مناسب و توسط شرکتهاي پشتيبان ، انجام گردد.

47. بررسي صحت فتومتري با استفاده از محلول دي کرومات پتاسيم : بيش از 50 ميلي گرم از دي كرومات پتاسيم را به مدت يكساعت در درجه حرارت 110 درجه سانتي گراد قرارداده تا خوب خشك شود. سپس با ترازوي كاليبره، دقيقاً 50 ميلي گرم از ماده فوق برداشته و در يك ليتر اسيد سولفوريك 0/01نرمال حل ميگردد . سپس اسپكتروفوتومتر توسط بلانك اسيد سولفوريك 0/01 نرمال در طول موج350 نانومتر صفر شده و جذب نوري محلول دي كرومات پتاسيم در اسيد سولفوريك قرائت مي‌گردد . جذب نوري در محدوده 005 /0 ± 0/536 نشاندهنده صحت فتومتريك دستگاه مي‌باشد.

48. صحت طول موج ارزيابي صحت طول موج به منظور ارزيابي ادعاي سيستم درتاباندن طول موجي است كه دستگاه براي آن تنظيم شده است . راحتترين و قابل دسترس ترين روش براي اسپكتروفتومترهايي كه با نور مرئي كار مي كنند، استفاده از محلول سيان‌مت‌هموگلوبين (20 ميكروليتر خون و 5 ميلي ليتر درابكين ) بوده که داراي حداكثر جذب نوري در طول موج 540 نانومتر است .

49. ابتدا با محلول درابكين به عنوان بلانك دستگاه را صفر كرده و سپس جذب نوري نمونه در طول موج 530 ، 535، 540 ، 545 و 550 نانومتر قرائت مي‌گردد.(لازم بذکر است پس از هر تغيير طول موج ، بايد جذب نوري دستگاه با محلول بلانك صفرگردد .) بر اساس طول موج و ميزان جذب ،يک منحني رسم مي‌گردد که در صورت وجود صحت طول موج ، حداکثر جذب نوري را در 540 نانومترنشان خواهد داد. نکته : بررسي صحت طول موج با استفاده از روش گفته شده براي فتومتر امکانپذير نمي‌باشد. اين بررسي مي‌بايست با استفاده از محلولها يا فيلترهاي مناسب و توسط شرکتهاي پشتيبان ، انجام گردد.

50. آزمون رانش فوتومتري (Drift) يکي از منابع اصلي خطا در اسپكتروفتومتري ، که به علت فرسودگي شديد منبع نوري رخ مي‌دهد، عدم پايداري مقدار جذب خوانش شده درطول زمان مي‌باشد. براي بررسي ، ابتدا دستگاه را با درابكين صفر نموده و پس از ريختن محلول سيان مت هموگلوبين در كووت و بستن درب آن با پارافيلم ، جذب نوري اين محلول هر5 تا 15 دقيقه يكبار (بمدت يكساعت) قرائت مي گردد. حداكثر تغيير مجاز در جذبهاي نوري قرائت شده طي اين مدت 0.005 ± مي‌باشد . بعنوان مثال اگرجذب محلولی در ابتدا 1.259باشد در مدت يکساعت می‌تواند در محدوده 1.259±0.005تغيير نمايد.