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L’AZIONE DI UNO XENOBIOTICO DIPENDE

L’AZIONE DI UNO XENOBIOTICO DIPENDE. raggiungimento. mantenimento. di adeguate concentrazioni nella sede in cui va ad agire. dalla quantità di xenobiotico. dalla entità e dalla velocità dei processi di:. ASSORBIMENTO DISTRIBUZIONE METABOLISMO

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L’AZIONE DI UNO XENOBIOTICO DIPENDE

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  1. L’AZIONE DI UNO XENOBIOTICO DIPENDE raggiungimento mantenimento di adeguate concentrazioni nella sede in cui va ad agire dalla quantità di xenobiotico dalla entità e dalla velocità dei processi di: ASSORBIMENTO DISTRIBUZIONE METABOLISMO ESCREZIONE entità e velocità dipendono dalle proprietà chimico-fisiche degli xenobiotici e sono condizionate dalla via di ingresso dipende in gran parte dalla liposolubilità, dal flusso ematico locale e dal legame alle proteine plasmatiche in forma immodificata se idrosolubili, composti trasformati se liposolubili trasformazione di una sostanza in composti, i metaboliti, più idrosolubili le reazioni metaboliche sono catalizzate da enzimi presenti soprattutto a livello epatico, sono essenzialmente di due tipi: più facilmente eliminabili REAZIONI DI FASE I o Fase di Funzionalizzazione idrolisi riduzione ossidazione REAZIONI DI FASE II o Fase di Coniugazione glucuronoconiugazione acetilazione solfatazione metilazione, etc.

  2. BIOTRASFORMAZIONE DI XENOBIOTICI FEGATO èl’organo primario per le trasformazioni (fisiologicamente deputato a modificare i nutrienti introdotti con la dieta) POLMONI, INTESTINO, RENI le trasformazioni degli xenobiotici determinano metaboliti più attivi (profarmaci) metaboliti inattivi (l’organismo cerca di proteggersi) metaboliti attivi o tossici (eroina morfina; paracetamolo) Data la natura enzimatica delle trasformazioni metaboliche, gli enzimi devono essere caratterizzati da una grande adattabilità alla struttura di un substrato così variabile come imprevedibile Questa versatilità è ottenuta con uno o più dei seguenti fattori GENETICI: differenze di specie e individuali polimorfismo genetico nell'acetilazione; polimorfismo genetico nell'ossidazione; idrolisi FISIOLOGICI:età (nel neonato la capacità metabolica epatica è ridotta;anche l'anziano presenta una ridotta capacità di biotrasformazione), sesso, gravidanza fenomeni di accumulo PATOLOGICI: insufficienza epatica (riduzione di enzimi epatici,digestivi) AMBIENTALI: fattori voluttuari (fumo, alcool), accidentali (contaminati dell’aria, acqua etc.), farmaci induzione e inibizione metabolica FLORABATTERICA: bioattivazione di precursori inattivi (es. cancerogeni da precancerogeni). INTESTINALE

  3. attività epatica di coniugazione dei farmaci pubertà adulto nascita anziano (> 65 anni) età IL METABOLISMO DEI FARMACI DIPENDE DALL’ETÀ ontogenesi del metabolismo epatico sono maggiormente deficitarie le reazioni di ossidazione e la coniugazione con acido glucuronico riduzione della massa epatica correlazione tra metabolismo del diazepam ed età 100 80 60 emivita, t ½(b), ore 40 20 0 10 40 60 70 30 20 80 50 età in anni

  4. DIFFERENZE NEL METABOLISMO TRA I DUE SESSI Maggiore attività CYP3A4 (verapamil, diazepam, prednisolone) CYP2D6 (propanololo) Minore attività CYP2C19 (piroxicam) CYP1A2 (caffeina) alcool-deidrogenasi gastrica etil-esterasi (cocaina) glucuronazione (morfina, aspirina, digossina)

  5. ENZIMI IMPLICATI NELLA BIOTRASFORMAZIONE xenobiotico fattore che determina l’intensità di azione fattore che determina la durata di azione ENZIMI ENZIMI termine degli effetti della sostanza e attenuazione della tossicità nomenclatura I singoli enzimi non possono essere denominati in base alle reazioni catalizzate avendo scarsa specificità di substrato sistemi arbitrari di nomenclatura che si basano sulla sequenza primaria di aminoacidi dei singoli enzimi distribuzione Sono ampiamente distribuiti nell’organismo il fegato è la sede più ricca di attività enzimatiche di biotrasformazione; presentano gli stessi enzimi anche :cute polmoni mucosanasale occhio tratto-gastrointestinale reni e ghiandole surrenali pancreas livello delle principali vie di esposizione cuore flora batterica intestinale cervello plasma e cellule ematiche mitocondri Sono localizzati in vari compartimenti subcellulari nucleo principalmente nel reticolo endoplasmatico (microsomi) (poiché molti xenobiotici sono lipofili) citosol lisosomi

  6. DISTRIBUZIONE DEGLI ENZIMI FEGATO e INTESTINO La biodisponibilità sistemica delle sostanze ingerite è limitata da (“eliminazione presistemica” o “eliminazione in 1° passaggio”) mediante estrazione e biotrasformazione di ciò che viene assorbito nel tratto gastrointestinale es. ossidazione dell’alcool ad acetaldeide MUCOSA GASTRICA Alcuni distretti extraepatici hanno contenuti abbastanza elevati di enzimi di biotrasformazione degli xenobiotici tuttavia se la dimensione di questi organi è modesta il contributo complessivo al processo di biotrasformazione è trascurabile Un ruolo importante nelle biotrasformazione solo delle sostanze inalate è svolto pur contenendo quantità di enzimi di biotrasformazione non dissimili dal fegato, EPITELIO DELLA MUCOSA NASALE Il fatto che i tessuti differiscono nella loro capacità di biotrasformare gli xenobiotici ha importanti implicazioni tossicologiche, specie per quanto riguarda la selettività del danno Nell’ambito di uno stesso organo, le cellule possono avere differente capacità di biotrasformare gli xenobiotici e questa eterogeneità ha anch’essa implicazioni rilevanti

  7. OGNI XENOBIOTICO PUÒ DARE ORIGINE A PIÙ DI UN METABOLITA xenobiotico

  8. METABOLISMO DEGLI XENOBIOTICI La biotrasformazione di uno xenobiotico può portare alla formazione di: l’esempio del paracetamolo

  9. REAZIONI DI BIOTRASFORMAZIONE DEGLI XENOBIOTICI Il metabolismo degli xenobiotici si attua attraverso due fasi Es. morfina, eroina e codeina sono tutte convertite in morfina-3-glucuronide la coniugazione con acido glucuronico è preceduta dalla Fase I per diretta coniugazione della sostanza con acido glucuronico alcuni xenobiotici (morfina) subiscono direttamente il metabolismo di Fase II ossidazione, riduzione idrolisi prodotti di coniugazione Fase I Fase II xenobiotico lo xenobiotico coniugato è solitamente inattivo a seguito della Fase I lo xenobiotico può risultare attivato, immodificato o, nella maggior parte dei casi, inattivato Le reazioni di Fase I hanno la finalità di inserire o mettere in evidenza nella molecola gruppi funzionali come –OH, -NH2, -COOH Le reazioni di Fase II usano i gruppi funzionali inseriti nelle reazioni di Fase I come un “terminale” per la coniugazione con molecole endogene

  10. VIE DI BIOTRASFORMAZIONE DEGLI XENOBIOTICI Localizzazione Reazione Enzima FASE I carbossilesterasi microsomi, citosol peptidasi sangue, lisosomi epossido-idrolasi microsomi, citosol Idrolisi Riduzione di azo- e nitrogruppi floraint., microsomi, citosol di gruppi carbonilici citosol di gruppi disolfuro citosol di gruppi solfossido citosol di chinoni citosol, microsomi dealogenazione microsomi Ossidazione alcool deidrogenasi citosol aldeide deidrogenasi mitocondri, citosol aldeide ossidasi citosol xantina ossidasi citosol monoaminossidasi mitocondri diaminoossidasi citosol prostaglandina H sintasi microsomi monoossigenasi flavinica microsomi citocromo P 450 microsomi è la più frequente FASE II coniugazione glucuronica microsomi coniugazione solforica citosol coniugazione con glutatione citosol, microsomi coniugazione con aminoacidi citosol, microsomi acetilazione mitocondri, citosol metilazione citosol citosol mitocondri microsomi DNA membrana nucleare

  11. REAZIONI DI FASE I: IDROLISI CARBOSSILESTERASI Sono presenti in molti tessuti e nel plasma. Idrolizzano numerosi composti endogeni: O H2C O C HO C H monoacil-glicerolo CH2OH O H2C O O C C O C H diacil-glicerolo CH2OH … altri lipidi esterificati Idrolizzano anche molti xenobiotici scarsa specificità possono idrolizzare non solo esteri

  12. REAZIONI DI FASE I: IDROLISI CARBOSSILESTERASI C H 3 O H C O 2 C H 3 C H N C H 2 3 H C + 2 O C H C H O H H O 2 2 2 C H N C H 2 3 C H C H H O 2 2 H N H N 2 2 C H 3 O H C O 2 C H 3 C H N C H 2 3 H C 2 N H C H C H O H H O 2 2 2 C H N C H 2 3 C H C H H 2 2 H N H N 2 2 2 O O O O H C H C 3 3 H O 2 C H H C H H 3 3 O O H H H H + O S H H O O S C H C H 3 3 N O 2 O O N O 2 P P H O + H C O 2 H C O - 3 O H 3 O O O H - O H C H C 3 3 O O H O 2 P P i P r - O O H + H - F i P r - O F i P r - O i P r - O idrolizzano xenobiotici aventi gruppi funzionali del tipo: ESTERE DI ACIDO CARBOSSILICO (procaina ) ( viene rapidamente inattivata nel sangue) anestetico locale + N (l’idrolisi enzimatica, come in vitro, è più lenta della procaina: a parità di ingombri sterici, RNH- è un gruppo uscente meno favorevole di RO- dell’estere, è in grado di mantenersi attiva dopo aver raggiunto il circolo sistemico) AMIDE (procainamide) aritmie cardiache L’azione delle carbossilesterasi influenza durata e sede di attività di certi farmaci. (notare che l’anello lattonico-un estere ciclico-rimane integro. Ciò a causa della maggiore stabilità dei sistemi ciclici: la struttura aperta è ottenibile solo in ambiente nettamente alcalino [pH > 8] nella forma HO-(CH2)nCOO-M+) TIOESTERE (spironolattone) (alcuni pesticidi organofosforici sono detossicati da citpcromo P450, monoossigenasi flaviniche, glutatione S-transferasi) ESTERE DI ACIDO FOSFORICO (paraoxon: dietil-p-nitrofenil fosfato) pesticida organofosforico ANIDRIDE ACIDA (diisopropilfluorofosfato DFP)

  13. CARBOSSILESTERASI t u t t a v i a, la presenza di sostituenti che sottraggono elettroni indebolisce il legame amidico rendendo la molecola più suscettibile all’idrolisi enzimatica carbossilesterasi sierica nota come pseudocolinesterasi anestetico succinilcolina agente miorilassante durata d’azione circa il 2% tra i caucasici è geneticamente carente dell’enzima prolungato blocco neuromuscolare apnea

  14. CARBOSSILESTERASI non sempre il metabolismo degli xenobiotici da parte delle carbossilesterasi comporta detossificazione in presenza di un alcool, possono catalizzare latrans-esterificazionedegli xenobiotici: ESTERE ETILICO (etilcocaina) etanolo CH3CH2OH tossico CH3CH metanolo attivazione metabolica ESTERE METILICO (cocaina) La cocaina ed alcuni suoi metaboliti vengono idrolizzati da una carbossilesterasi epatica che in presenza di etanolo proveniente da bevande alcoliche, produce trans-esterificazione trasformando il gruppo carbossimetilico in carbossietilico COCAINA-COOCH3 COCAINA-COOCH2CH3 gli esteri etilici sono ancora più attivi e lipofili incremento di attività e tossicità epatica MORTALE (ad alti dosaggi e in presenza di etanolo)

  15. non sempre il metabolismo degli xenobiotici da parte delle carbossilesterasi comporta detossificazione CARBOSSILESTERASI O O CH3O-C-CH2CH2-C-OCH3 dimetilestere dell’acido succinico 2 x CH3OH HOOC- CH2-CH2-COOH metanolo acido succinico epitelio nasale degenerazione dell’epitelio carbossilesterasi carbossilesterasi O CH3-C-O-CH-CH2 acetato di vinile O O- CH-CH3 CH3-C-OH acetaldeide acido acetico legame covalente con DNA e proteine tumori nasali

  16. CARBOSSILESTERASI carbossilesterasi non sempre il metabolismo degli xenobiotici da parte delle carbossilesterasi comporta detossificazione O C N N CH3 CH3 CH3 1,3-dimetil-3-fenil-1-nitrosurea O [HO- N N-CH3] C metildiazonio idrossido N OH CH3 acido N-metil-N-fenilcarbammico legame covalente con il DNA tumori cutanei

  17. CARBOSSILESTERASI non si ha ancora una classificazione sistematica La limitata specificità di substrato preclude la possibilità di denominare questi enzimi in base alle reazioni che catalizzano. Aldridge (1953) ha classificato le carbossilesterasi in base alla natura delle loro interazioni con gli organofosforici ESTERASI A ESTERASI C idrolizzano gli organofosforici non interagiscono con organofosforici ESTERASI B sono inibite dagli organofosforici (contengono un residuo di cisteina nel sito attivo) (contengono un residuo di serina nel sito attivo) In realtà il termine carbossilesterasi è in un certo senso poco appropriato perché questi enzimi possono agire anche come amidasi o fosfatasi

  18. REAZIONI DI FASE I: IDROLISI PEPTIDASI Molti enzimi vengono sintetizzati come zimogeni (proenzimi), precursori inattivi. L’attivazione consiste nella rimozione di una piccola parte della catena polipeptidica, a opera di peptidasi specifiche. CARBOSSIPEPTIDASI AMINOPEPTIDASI ENDOPEPTIDASI H O R … … NH2 NH C COOH C NH C catena polipeptidica H OH aa aminoterminale aa carbossiterminale aa endopeptidici l’idrolisi è rapida se il residuo carbossiterminale ha una catena R aromatica o alifatica lunga TRIPSINA (spezza il legame peptidico sui carbonili Lys o Arg) CHIMOTRIPSINA (spezza il legame peptidico ai carbonili della Phe, Trp o Tyr)

  19. REAZIONI DI FASE I: IDROLISI EPOSSIDO IDROLASI trans addizione di H2O agli epossidi alchenici o ossidi arenici (oxirani) sono stereoselettive fornendo trans-dioli importante ruolo nella detossificazione la notevole reattività degli epossidi è dovuta alla deformazione degli angoli di legame dai normali valori di 109° a circa 60° stirene 7,8-epossido naftalene 1,2-ossido + H2O + H2O stirene 7,8-glicole naftalene 1,2-diidrodiolo Nel corso del metabolismo ossidativo di composti olefinici e aromatici si formano epossidi reattivi che costituiscono un substrato per l’epossido idrossilasi

  20. REAZIONI DI FASE I: IDROLISI EPOSSIDO IDROLASI 1 2 1 2 1 1 O 1 0 3 9 8 4 H O H O O 7 5 6 O H O H P450 O H O O H Gli epossidi, in assenza di idrolasi o glutatione e glutatione transferasi che fornisce un addotto nettamente più idrofilo inerte e facilmente coniugabile con acido glucuronico come a-glicole, potrebbero attaccare proteine e DNA innescando processi di mutazione e cancerogenesi Es. alta attività cancerogena del benzo[a]pirene (idrocarburi aromatici policiclici) sono trasformati dal citocromo P450 in numerosi ossidi arenici che stabiliscono legami covalenti con il DNA Regione di baia è un esempio di diolo epossido di regione di baia RUOLO “TOSSICANTE” P450 epossido idrolasi P450 PHS benzo[a]pirene (+)benzo[a]pirene7,8-ossido (-)benzo[a]pirene7,8-ddidrodiolo (+)benzo[a]pirene 7,8-diidrodiolo-9,10-ossido RUOLO DETOSSICANTE è più potente del benzo[a]pirene epossido idrolasi resistente alla riduzione prodotta dalla epossido idrolasi legame covalente con il DNA benzo[a]pirene 4,5-ossido benzo[a]pirene 4,5-diidrodiolo mutazione del 12° codone dell’oncogene Hras • altamente mutageno da test sui batteri • (perché manca l’epossido idrolasi) • poco mutageno nelle cellule di mammifero tumori del polmone e della cute Una caratteristica comune di tutti gli epossidi di regione di baia è la loro resistenza alla epossido idrolasi dovuta all’impedimento sterico da parte di un vicino gruppo diidrodiolico

  21. EPOSSIDO IDROLASI REAZIONI DI FASE I: IDROLISI È tra gli enzimi inducibili della frazione microsomiale del fegato La sua induzione è associata a quella del citocromo P450 È distribuito in quasi tutte le sedi: nel FEGATO esistono 3 forme immunologicamente distinte per Western blot prodotti da geni distinti con diversa specificità di substrato reticolo endoplasmatico citosol reticolo endoplasmatico Nel sito attivo è presente un residuo basico sull’atomo di C più accessibile dell’anello ossiranico His431 + OH- H+-O-H nucleofilo

  22. REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE più o meno specifiche REDUTTASI i substrati più comuni ed i relativi prodotti di riduzione sono: Substrato Prodotti di riduzione Ar-N=N-Ar Azocomposti Ar-NH-NH-Ar Idrazocomposti 2 Ar-NH2 Arilammine Ar-NO2 Nitroderivati Ar-NO Nitrosoderivati Ar-NHOH Arilidrossilamine ArNH2 R-CHO Aldeidi Alcoli I R-COO Chetoni Alcoli II R-S-S-R Disolfuri 2 R-SH Tioli o mercaptani R-S-R Solfuri R-SO2-R Solfoni R-SO-R Solfossidi Idrochinoni Chinoni Alogenoalcani Elementi inorganici (es. arsenico pentavalente) Le sostanze esogene contenenti gruppi funzionali riducibili vengono ridotte dagli enzimi microsomialie citoplasmatici. Le sostanze esogene assunte per via orale possono essere ridotte già dai batteri intestinali. Anche nella riduzione si possono formare metabolititossici. A tutte le reazioni di riduzione è comune il fatto che gli enzimi partecipanti trasferiscono inizialmente 2 equivalenti di H dal cofattore NADH o NADPH alla molecola esogena. A seconda dei gruppi funzionali l’H: rimane ligato alla molecola esogena (alchene, azocomposto o chinone) provoca l’eliminazione di un atomo di O (nitrocomposti e N-ossidi)

  23. REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE REDUTTASI AZO- e NITROGRUPPI operate da batteri intestinali catalizzate da 2 enzimi epatici: citocromo P450 e NADPH-chinone ossidoreduttasi (flavoproteina del citosol nota come DT-diaforasi) richiedono NADPH e sono inibite dall’ossigeno (ambiente anaerobico del digerente) AZO- RIDUZIONE NITRO- RIDUZIONE prontosil nitrobenzene [4H] [2H] + 1,2,4-triaminobenzene sulfanilamide (principio attivo) nitrosobenzene [2H] fenilidrossilamina [2H] anilina importanza tossicologica

  24. REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE GRUPPI CARBONILICI (aldeidi e chetoni) nel sangue e citosol di: fegato rene cervello etc. CARBONIL- REDUTTASI i loro substrati fisiologici sono le prostaglandine ridotti anche dalla alcool deidrogenasi sono presenti carbonil-reduttasi ad alta e bassa affinità la cui attività varia anche di 10 volte da un individuo all’altro REDUTTASI GRUPPI DISOLFURO nel citosol Alcuni disolfuri vengono ridotti e scissi nei rispettivi componenti sulfidrilici Es. riduzione del gruppo disolfuro nella biotrasformazione del disulfiram (Antabuse) 2 X disulfiram dietiltiocarbammato Es. riduzione glutatione dipendente dei gruppi disolfuro di xenobiotici NADP+ XSH XSH NADPH + H+ GSH GSH 2GSH XSSX XSSG GSSG glutatione-S-transferasi glutatione reduttasi glutatione-S-transferasi GSH, glutatione XSSX, disolfuro dello xenobiotico GSSG, glutatione ossidato

  25. REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE REDUTTASI SOLFOSSIDO e N-OSSIDO nel citosol di: fegato rene a n a l o g a me n t e la riduzione dei gruppi N-ossido può far tornare indietro l’effetto della N-ossigenazione delle amine formate dalle monoossigenasi flaviniche generati per ossidazione da parte del citocromo P450 o monoossigenasi flaviniche la riduzione dei gruppi solfossidi può far tornare indietro l’effetto della solfossidazione possono prolungare quindi l’emivita di certi xenobiotici NADPH-CHINONE OSSIDO REDUTTASI DT-DIAFORASI CHINONI flavoproteina citosolica idrochinoni Al pari dei chinoni sono substrati anche numerosi agenti potenzialmente tossici (epossidi chinonici, chinonimmine, azo-composti e C-nitroso derivati da arilamine) Nell’uomo questi enzimi sono codificati da 4 distinti loci genici (DIA1 fino a DIA4) Il 4° locus codifica la NQ O1 è inducibile responsabile di gran parte dell’attività nei tessuti umani NQ O2 è non inducibile espresso in modo polimorfico NADPH-CITOCROMO P450 REDUTTASI CHINONI flavoproteina microsomiale radicale libero semichinonico

  26. REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE DEALOGENAZIONE (F, Cl, Br, I dalle sostanze alifatiche) REDUTTASI nei microsomi DEALOGENAZIONE RIDUTTIVA (es. CCl4, fluotano) X X X X + 2H X-C-C-X X-C-C-H - HX X H X H penta-aloetano tetra-aloetano catalizzata dal citocromo P450 tramite 3 meccanismi principali DEALOGENAZIONE OSSIDATIVA (es. fluotano) X X X X + [O] X-C-C-X X-C-C-O - HX X H X penta-aloetano tetra-aloacetilaldeide catalizzata dal citocromo P450 DEALOGENAZIONE DI 2 ALOGENI SU ATOMI DI C ADIACENTI X X X X + 2H X-C-C-X C C - 2H X X H X penta-aloetano tri-aloacetaldeide catalizzata dal citocromo P450 e dalla glutatione S-transferasi Ruolo importante nella attivazione metabolica di molti alcani alogenati

  27. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE ALCOL DEIDROGENASI (ADH) ALCOLI 1a citosol di: fegato rene polmone mucosa gastrica Bassa specificità, utilizza NAD+ come coenzima per ossidoriduzioni metanolo formaldeide acido formico ALDH ADH etanolo acetaldeide* acido acetico alcoli semplici aldeidi acidicarbossilici circa 1/3 è metabolizzato anche da CYP2E1 (indotto) meno tossici e facilmente eliminabili tossiche legami covalenti *triptofano carboline O O ALDH ADH R-C R-C R-CH2OH OH H NAD+ + H2O NADH + H+ NAD+ NADH + H+ Solo alcuni ALCOLI 2a chetoni ALCOLI 2a e ALCOLI 3a direttamente coniugati (eliminati come tali) VARIABILITÀ subunità 40 kDa subunità 40 kDa dimero proteico Poiché ADH dell’uomo loci genici codificanti subunità varianti alleliche a ADH1 b b2 b3 b1 ADH2(gene polimorfico) g ADH3(gene polimorfico) g1 g2 Le ADH nell’uomo comprendono 8 subunità che possono combinarsi come eterodimeri o omodimeri p ADH4  ADH5

  28. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE Le differenti forme molecolari di ADH vengono suddivise in 3 classi principali comprendenti i vari isoenzimi ALCOL DEIDROGENASI (ADH) CLASSE I CLASSE III ADH5 ADH3 ADH2 ADH1 CLASSE II cc gg (1,2) aa bb (1,2,3) ADH4 oppure oppure pp Ossidano alcoli a catena lunga e gli alcoli aromatici ab bg (1,2) ag Ossidano alcoli alifatici di dimensioni maggiori Non vengono inibiti dal pirazolo Responsabili dell’ossidazione dell’etanolo e altri alcoli alifatici a basso PM Non vengono inibiti dal pirazolo Sono fortemente inibiti dal pirazolo Gli isoenzimi della classe I differiscono nella loro capacità di ossidare l’etanolo b2b2 omodimero “ADH atipiche” b2 eterodimeri … sono isoenzimi particolamente attivi nell’ossidare l’EtOH a pH fisiologico L’ADH atipica è espressa con frequenza molto minore nei caucasici: < 5% negli americani; ˜ 8% negli inglesi; ˜ 12% nei tedeschi; ˜ 20% negli svizzeri negli afroamericani (< 10%), negli americani nativi (zero), negli indiani asiatici (zero) sono responsabili della conversione eccezionalmente rapida in acetaldeide che si osserva nell’85% della popolazione giapponese e cinese ( intolleranza all’alcool) accumulo di acetaldeide vasodilatazione al viso, palpitazioni e nausea

  29. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE ALCOL DEIDROGENASI (ADH) ISOENZIMI DELLA CLASSE I ADH3 ADH1 ADH2 fegato principalmente rene tratto gastrointestinale polmone per cui l’ossidazione dell’alcol differisce alquanto in minor quantità ADH3 (gg) stomaco ha una minore affinità (Km >) per l’alcol ma dopo ingestione di bevande dispone di una grande quantità di substrato Tale variabilità è la base della risposta agli xenobiotici. Infatti le forme isoenzimatiche, pur catalizzando la stessa reazione, possono avere costanti cinetiche diverse e diversa compartimentazione . Ciò permette di trasformare gli xenobiotici in relazione al loro percorso e alla loro concentrazione relativa durante tale percorso.

  30. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE ALDEIDI ALDEIDE DEIDROGENASI (ALDH) mitocondri e citosol Bassa specificità: trasforma sia aldeidi alifatiche che aromatiche utilizza NAD+ come coenzima per ossidoriduzioni ALDH R-COOH R-CHO NAD+ + H2O NADH + H+ Le differenti forme molecolari di ALDH vengono suddivise in 3 classi ALDH I ALDH III citosol citosol stomaco (altri distretti extraepatici) ALDH II grande varietà di xenobiotici a struttura aldeidica mitocondri acetaldeide subunità 85 kDa subunità 85 kDa subunità 54 kDa subunità 54 kDa subunità 54 kDa subunità 54 kDa subunità 54 kDa subunità 54 kDa subunità 54 kDa subunità 54 kDa mutazione puntiforme (Glu 487 Lys 487) isoforma meno attiva presente nel 45-50% di cinesi e giapponesi (insieme alla “ADH atipica”)

  31. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE ALDEIDE OSSIDASI Sono enzimi metalloflavoproteinici XANTINA OSSIDASI intervengono nella trasformazione intermedia delle sostanze RIDUZIONE OSSIDAZIONE dei derivati piridinici delle purine delle pirimidine Km elevata rispetto a quella dell’ALDH l’aldeide ossidasi partecipa in maniera poco significativa alla degradazione delle aldeidi

  32. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE il gruppo aminico sia legato a un gruppo metilenico non sostituito (es. benzilamina). anilina anfetamina OH MAO + H2O RCH NH -NH3 RCH2NH2 RCH RCHO NH2 AMINE 1a MONOAMINOSSIDASI (MAO) mitocondri in tutti i tessuti funzione fisiologica è quella di disattivare amine degli alimenti (tiramina) catecolamine altre amine biogene Bassa specificità per i substrati: preferisce le ammine 1a alchiliche e aromatiche in secondo luogo anche le ammine 2a e 3a UNICA CONDIZIONE *FAD come coenzima non sono substrati *FAD= flavin adenin dinucleotide AMINE 1a DIAMINOSSIDASI (DAO) citosol Catalizzano la stessa reazione nelle sostanze provviste di due centri basici: istidina istamina lisina cadaverina decarbossilazione ornitina putrescina

  33. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE acido arachidonico 2O2 cicloossigenasi O COOH O OOH idroperossi-endoperossido (PGG2) COOH xenobiotico A prostaglandina idroperossidasi B O COOH O OH idrossi-endoperossido (PGH2) PROSTAGLANDINA H SINTASI (PGS) microsomi nelle cellule epiteliali della maggior parte degli organi Complesso enzimatico contenente Fe che catalizza la biosintesi di prostaglandine e trombossani Le sostanze esogene possono essere “co-ossidate” mediante l’attività perossidasica dell’enzima PGS ossida una quantità ampia di sostanze deidrogenazioni fenoli aminofenoli N-demetilazioni amine aromatiche prostaglandina H sintetasi epossidazioni catalizza entrambe solfossidazioni N-idrossilazioni amine aromatiche idrossilazioni composti aromatici policiclici Etc. il contributo totale di questo enzima al processo di disattivazione di xenobiotici può anche sembrare piccolo (crf. numerose reazioni dovute al citocromo P450) t u t t a vi a se si considera che la bioattivazione di sostanze cancerogene può avvenire nei tessuti bersaglio, allora la PGS assume un ruolo importante

  34. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE MONOSSIGENASI FLAVINICA (FMO) attiva l’OSSIGENO MOLECOLARE microsomi fegato polmoni Complesso enzimatico FAD che utilizza NADPH come coenzima FMO ossida i seguenti gruppi funzionali: struttura substrato prodotto dipende dal tipo di S se FMO porta a metaboliti inattivi o attivati R3N O (N-ossido)* R3N 3a amine R2N-OH (idrossilamina) R2N-H aclicliche cicliche aromatiche eteroaromatiche 2a idrossilamina R2N-O (nitrone) R2N-OH idrazina 1,1-disostituita R-CH2, R)N-NH2 R-CHO + R-NH-NH2 (aldeide+ idrazina monost.) tiolo RSSR (disolfuro) RSH RSR disolfuro RSSR O (tioetere) O tioetere RSR RSR O (solfone) *la molecola di ossigeno legata alla flavina viene ridotta a perossido per ossidazione dello xenobiotico un atomo di O del perossido è trasferito sulla molecola esogena enzima FAD .OOH + NADP+ O2 + NADPH + H+ + enzima FAD R3NH + enzima FAD .OOH R3N O + enzima FAD .OH enzima FAD .OH + H+ Enzima FAD + H2O

  35. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE H2O O2 R-OH RH N N Fe3+ N N P-450 reduttasi è il sistema enzimatico più diffuso per l’ossidazione di xenobiotici CITOCROMO P450 CYP 450 microsomi famiglia di enzimi che permette all’organismo di ossidare praticamente tutte le sostanze organiche il nome deriva dal fatto che la forma ridotta con Fe2+ lega CO per dare un complesso con un massimo di assorbimento a 450 nm (nel blu) È COSTITUITO DA: • eme-proteina, (ferro-porfirinico) • trasporto di e- e • attivazione • di O2 ione ferroso si riferisce al ruolodell’eme-proteina: contiene il centro attivo a cui la sostanza esogena e l’O2 si legano e su cui avviene il trasferimento di ossigeno al substrato • NADPH associato a NADPH reduttasi • altri cofattori L’insieme di questi enzimi è contenuto nella matrice fosfolipidica del reticolo endoplasmatico La presenza dei fosfolipidi è fondamentale per permettere sia le reazioni fra i due enzimi che l’arrivo del substrato a livello del sistema enzimatico attivo

  36. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE NADPH e- citocromo P450 reduttasi e- Fe citocromo P450 FMN citoplasma citocromo b FAD membrana Componenti molecolari del sistema P450 nella membrana del reticolo endoplasmatico GRANDE VERSATILITÀ CATALITICA CITOCROMO P450 CYP 450 differenziatosi geneticamente per il metabolismo di steroidi e acidi biliari è in tutte le specie polimorfismo genetico polimorfismo inducibile uno dei più versatili sistemi di difesa da sostanze estranee alla biologia cellulare REAZIONE FONDAMENTALE MONOOSSIGENAZIONE un atomo di ossigeno viene incorporato nel substrato, l’altro atomo di ossigeno è ridotto ad acqua con gli equivalenti riducenti forniti dal NADPH durante la catalisi, il CYP450 si lega direttamente ad S e all’O2 ma non interagisce direttamente con il NADPH prodotto (ROH) + H2O + NADP+ substrato (RH) + O2 + NADPH + H+ il meccanismo con cui CYP450 riceve e- dal NADPH dipende dalla sua localizzazione subcellulare

  37. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE CICLO CATALITICO CITOCROMO P450 CYP 450 il funzionamento e le possibili interazioni di questo complesso sistema enzimatico con i substrati è rappresentabile al meglio dal cosiddetto ciclo di ossidazione A substrato (RH) prodotto (ROH) Fe3+ I P450 Fe3+ (RH) Fe3+ ROH B G e- ossidazione del substrato II IV attivazione dell’ossigeno (FeO)3+ RH Fe2+ (RH) agente ossidante F C H2O O2 (CO) si lega ancora più saldamente H+ Fe2+ O2 RH Fe2+OOH RH E D III , e- H+ NADPH-citocromo citocromo b I microsomi epatici di tutte le specie di mammifero contengono numerosi enzimi P450 e ognuno di essi ha la capacità di catalizzare differenti tipi di reazioni

  38. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE La specificità di substrato, spesso molto ampia e non sovrapponibile tra i diversi sottotipi rende impossibile denominare gli enzimi in base alla reazione catalizzata CITOCROMO P450 CYP 450 REAZIONI CATALIZZATE DAL CYP 450 Isomerizzazione (es. conversione di PGH2 in trombossano e prostaciclina) alifatiche (tolbutamide) Idrossilazione aromatiche cumarina S-ossigenazione (omeprazolo) N-ossigenazione (4-metilnitrosamina-1-(3piridil)butan-1-one (NNK), specifica del tabacco) Dealchilazione (diazepam; 7-etossiresorufina; 6-metilmercaptopurina) (N-; O-; S-) + Deaminazione ossidativa [o] anfetamina Desolforazione ossidativa (parathion) ossidativa Dealogenazione riduttiva azo-gruppi Riduzione nitro-gruppi Scissione di esteri (loratadina) Deidrogenazione (nicotina) Attraverso tecniche del DNA ricombinate è stato possibile determinare la sequenza della catena aa di numerosi enzimi P 450

  39. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE La sequenza aa dell’eme-proteina determina l’affinità dell’enzima CYP per una determinata classe chimica di substrato: CITOCROMO P450 CYP 450 lega per affinità idrocarburi aromatici sacca lipofila in grado di legare sostanze apolari fenilalanina aa apolari ( leucina, isoleucina, valina) CENTRO CATALITICO aa bicarbossilici ( glutamato, aspartato) lisina arginina legano composti con centri cationici legano composti carichi negativamente

  40. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE CITOCROMO P450 CYP 450 La sequenza aa costituisce la base per classificare e denominare gli enzimi P 450 NOMENCLATURA in base al grado di parentela con la sequenza di geni (> 300) il principio su cui si basa la nomenclatura per i prodotti genici è il grado do omologia della sequenza aa che deriva dalla sequenza di acidi nucleici del gene codificante Il singolo enzima viene denominato con la sigla CYP seguita da: FAMIGLIA (1, 2, 3, …) 1° numero ˜ 35% omologia lettera maiuscola SOTTOFAMIGLIA (2A, 2B...) 40-60% omologia 2° numero SOTTOTIPO (2A1, 2A2...) > grado omologia Es. CYP1A1

  41. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE I nomi sono assegnati in ordine cronologico indipendentemente dalla specie di origine (es. nel fegato dell’uomo è espresso CYP2A6, ma è l’unico 2A) CITOCROMO P450 CYP 450 Famiglie di enzimi P 450 procariotici ed eucariotici Famiglia n° sottofamiglie n° enzimi Funzioni enzimatiche CYP1 1 2 addizione O2xenobiotici CYP2 8 57 addizione O2xenobiotici, steroidi CYP3 2 10 addizione O2xenobiotici, steroidi CYP4 2 10 idrossilazione diacidi grassi CYP7 1 1 colesterin-7a-idrossilasi CYP11 2 3 steroide-11b-idrossilasi CYP17 1 1 steroide-17a-idrossilasi CYP19 1 1 aromatasi CYP21 1 1 steroide-21-idrossilasi CYP27 1 1 colesterina-27-idrossilasi CYP51 1 1 lanosterolo… in saccaromiceti CYP52-CYP57 9 inlieviti e aspergilli CYP101 camferossigenasi in batteri CYP102-107 8 in diversi ceppi di batteri il numero di enzimi P450 in ciascun sottotipo differisce da una specie all’altra

  42. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE FAMILY OF ENZYMES (CYPs) IN LIVER Proportion of Pharmaceuticals Metabolized by Individual Cytochrome P450’s Major P450 Content of Human Liver P-4502C9/10 P-4502B6 P-4501A2 P-4502B6 P-4502C19 P-4502E1 P-4502A6 P-4502C9 Other P-4502C19 P-4502E1 P-4502C8 P-4501A2 P-4503A P-4503A P-4502A6 P-4502B6 L’enzima principale del fegato umano è il CYP3A4 seguito da CYP2E1, CYP2C9 e CYP1A2 CITOCROMO P450 CYP 450 Gli enzimi citocromo P 450 dell’uomo Famiglia Organo Substrato CYP1A1 polmone, placenta,IPA (es. benzo[a]pirene) linfociti, pelle CYP1A2 fegatoamine e ammidi aromatiche e N-eterocicliche caffeina, fenacetina, aflatossina B1 CYP2A6 fegatocumarina, dietilnitrosamina CYP2C9 fegato,antiepilettici (S-mefenitoina) intestino tenue CYP2D6 fegatoantiaritmici, b-bloccanti, antidepressivi CYP2E1 fegato, esofago alcani, alcoli, acetone, benzene, anilina, etc. intestino tenue CYP3A4 fegato, aflatossina, nifedipina, cancerogeni aromatici tratto gastrointestinale

  43. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE I livelli e l’attività di ciascun enzima P 450 variano da individuo a individuo in rapporto a fattori ambientali e/o genetici CITOCROMO P450 CYP 450 bloccano la sintesi dell’enzima o determinano la produzione di enzima inattivo o poco efficiente dal punto di vista catalitico mutazioni infezioni, esposizione a xenobiotici a causa di ATTIVITÀ deprimono la sintesi del P450 con l’inibizione del CYP 450, un farmaco può bloccare la trasformazione di un altro xenobiotico e modificarne la risposta (l’inibizione riproduce gli effetti di un deficit genetico) esposizione a sostanze che inibiscono o rendono inattivo l’enzima presente duplicazione genica sovraespressione della proteina enzimatica esposizione a xenobiotici a causa di ATTIVITÀ induzione della sintesi del CYP 450 È il meccanismo più frequente stimolazione da parte di uno xenobiotico dell’enzima già presente è necessaria l’interazione con una specifica proteina recettore; il complesso con il recettore migra all’interno del nucleo e legandosi alla regione genica di promozione dell’enzima mette in azione la sintesi di mRNA Sostanze esogene inducenti nell’uomo Sostanza esogena Enzima P450 indotto fumo di tabacco CYP1A1 fumo di tabacco, carne alla griglia CYP1A2 indolo nel cavolo di Bruxelles, alcol CYP2E1 barbiturici, desametasone, rifampicina CYP3A4

  44. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE In una % significativa della popolazione, gli effetti di alcuni xenobiotici sono accentuati dalla carenza ereditaria di enzimi P450 CITOCROMO P450 CYP 450 POLIMORFISMO GENETICO CYP 2D6 ereditate come caratteri autosomici recessivi CYP 2C19 ha le più importanti implicazioni cliniche: la sua attività è distribuita bimodalmente nella popolazione in cui si possono distinguere 2 fenotipi AA Frequenza relativa degli alleli Aa aa ultraveloci (amplificazione del gene 2D6) Attività enzimatica relativa rapidi metabolizzatori omozigoti per un carattere autosomico recessivo e non posseggono l’enzima a livello epatico lenti (3-10%)

  45. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE CITOCROMO P450 CYP 450 TRASPORTATORI DI ELETTRONI sito reattivo ¨ + H+ + 2e- NAD+ NADH NAD+ (nicotinamide adenin dinucleotide R = H) NADP+ (nicotinamide adenin dinucleotide R = PO32-) sito reattivo sito reattivo + 2H+ + 2e- FAD FADH2 FAD (flavin adenin dinucleotide: flavinmonunucleotide(FMN), AMP)

  46. REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE CITOCROMO P450 CYP 450 scarsa specificità di substrato* ogni difetto genetico può influenzare il metabolismo di molti farmaci citocromo P450 tuttavia, l’osservazione che soggetti con difetto genetico di un particolare P450 hanno un metabolismo lento di una o più sostanze principio generale: la velocità di eliminazione di uno xenobiotico può essere in larga misura determinata da un singolo CYP 450 ciò sembra contraddire * In realtà i diversi CYP450 pur potendo catalizzare uno stesso xenobiotico, hanno caratteristiche di affinità molto diverse tra loro FENOTIPIZZAZIONE DEL CYP 450 1) Analisi di correlazione: velocità di trasformazione di un substrato in prodotto in frazioni microsomiali umane, in relazione al contenuto dei singoli tipi P450 presenti nelle varie frazioni. 2) Inibizione chimica: inibizione enzimatica con composti noti, tipici di una certa isoforma. Inibitori non competitivi. 3) Inibizione con anticorpi specifici. 4) Uso di cDNA di isoforme specifiche di CYP450.

  47. REAZIONI DI FASE II: DI CONIUGAZIONE Sono reazioni enzimatiche di biosintesi per mezzo delle quali un composto esogeno o un metabolita derivato dalle reazioni di fase I si lega in modo covalente con una molecola endogena mediante –OH –COOH -NH2 -SH La maggior parte degli enzimi preposti si trova nel citosol unica eccezione (microsomi) S ENDOG. ENZIMA SUBSTRATO REAZIONE ac. UDP glucuronico UDP-glucuronil transferasi fenoli, alcoli: morfina, diazepam coniug. glucuronica fosfoadenisil fosfosolfato fenoli, alcol, amine: paracetamolo sulfotrans. coniug. solforica GSH-S- transferasi coniug. con glutatione epossidi acido etacrino acil-CoA glicina trans. coniug. con aa glicina acidi carbossilici N-acetil transferasi acetilazione acetil CoA amine: clonazepam metilazione S-adenosil metionina dopamina, adren., istamina transmetilasi tranne queste, causano un aumento notevole della idrofilicità dello xenobiotico Il meccanismo di reazione prevede consumo di energia, utilizzata per attivare i cofattori ad intermedi ad alta energia. si svolgono nel corso di reazioni con xenobiotici attivati Le reazioni di fase I procedono in genere più lentamente di quelle di fase II la velocità di eliminazione è in genere determinata dalle reazioni di fase I

  48. REAZIONI DI FASE II: DI CONIUGAZIONE Gli agenti coniuganti più comuni sono: ACIDO GLUCURONICO ACIDO SOLFORICO GLICINA La sequenzialità delle coniugazioni di una stessa sostanza può dare origine a svariati prodotti di coniugazione Es.acido p- amminosalicilicopuò essere substrato di più di un enzima metabolizzante, così che processi di coniugazione diversi possono competere per lo stesso gruppo funzionale coniugazione con glicina acil glucuronazione O. solfoconiugazione O. glucuronazione acetilazione N. glucuronazione vasta gamma di metaboliti

  49. REAZIONI DI FASE II: GLUCURONAZIONE UDP-GLUCURONIL TRANSFERASI trasferisce l’acido glucuronico sul substrato formando un legame b-glicosidico microsomi Differenti classi di coniugati di acido glucuronico gruppo funzionale tipo di glucuronide esempio C-O-glucuronide alcol alifatico tricloroetano aliciclico esobarbital benzilico metilfenilcarbinolo fenolico 3-idrossi-benzo[a]pirene acido carbossilico alifatico acido a-etilesano aromatico acido a-aminobenzoico chetone a,b insaturo progesterone N-O-glucuronide N-idrossi- N-acetil-N-fenil-idrossilamina N-glucuronide carbamato meprobramato arilamina 2-naftilamina amina alifatica 3a tripelennamina S-glucuronide ariltiolo tiofenolo C-glucuronide 1,3-dicarbonil fenilbutazone L’uomo e i grandi primati sono le uniche specie in grado di formare i glucuronidi di ammonio quaternario dalle amine 3a

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