Isolation of cDNA clones encoding T cell-specific membrane-associated proteins

1. Isolation of cDNA clones encoding T cell-specific membrane-associated proteins Sequence relationships between putative T-cell receptor polypeptides and immunoglobulins Mark M. Davis, et al. Nature Vol. 308, March 1984 01.03.2010 Matthias Weißkopf

2. Gliederung • Ausgangspunkt • Ziel des Versuchs • Methoden • Ergebnis / Zusammenfassung • Heutiger Stand

3. Stand der Dinge (1984) • T-Zellen erkennen Antigene anders als B-Zellen und in einem anderen Zusammenhang • Struktur von Immunglobulinen bekannt • Identifikation des T-Zell Rezeptor Proteins, u.a. von Jim Allison • Heterodimer über Disulfidbrücken verbunden • Besteht aus konstanten und variablen Regionen

4. Ziel des Versuchs • Isolierung der Gene, die für den T-Zell Antigen Rezeptor kodieren • Vier Annahmen zur Identifikation wurden aufgestellt. Die Gene müssen: • ausschließlich in T- und nicht in B Zellen exprimiert werden • membrangebunden sein • von Genen kodiert werden die sich neu anordnen, wie jene bei Immunglobulinen • aus konstanten und variablen Bereichen bestehen.

5. Methoden • Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA T-Zelle Isolierung der mRNA von membrangebunden Polysomen a 5‘ 3‘ b 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ a b c c cDNA erstellen d d

6. Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA Hybridisierung mit Überschuss an B-Zell mRNA B-Zelle a b c a b f c d e e

7. Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA • Trennung von Einzel- und Doppelsträngen per Hydroxyapatit Säule • Weitere Eingrenzung durch Hybridisierung mit ähnlich hergestellter T-Zell cDNA Probe • cDNA Fragmente wie „d“ und „f“ mögliche Kandidaten für T-Zell Rezeptor • Einklonieren der cDNA in Plasmide -> etwa 30 TM Klone d f d

8. Überprüfen von somatischer Rekombination • Hybridisierung an genomische DNA aus Leber- und T-Zellen • Radioaktiv markierte Inserts aus den Klonen als Sonde • Verdau mit Pvu II -> Southern Blot

9. Überprüfen von somatischer Rekombination • Insert aus TM86 besitzt anderes Muster • Somatische Rekombination findet statt • Annahme: Rekombination des Rezeptorgens unterscheidet sich bei T-Zellen unterschiedlicher Antigenspezifität • Überprüfung durch Hybridisierung mit Insert von TM86

10. Überprüfen von somatischer Rekombination • Unterschiedliche Bindemuster in allen untersuchten T-Zelllinien • B-Zellen besitzen selbes Muster wie Leberzellen • -> Diese Art von Rekombination findet nur in T-Zellen statt

11. Sequenzierung des Gens • Screening von Thymozyten mit TM86 für weitere gleichartige Klone • 86T1, 86T3 und 86T5 • Sequenzierung der Thymusklone zeigt Genstruktur mit variablen und konstanten Bereich • Starke Ähnlichkeit zu Immunglobulinen • Variable, Konstante und Joining Regionen • Strukturanalyse zeigt Transmembran Abschnitt

12. Sequenzanalyse

13. Ergebnis / Zusammenfassung • TM86 ähnliche mRNAs kodieren für eine Kette des T-Zell Rezeptors (β-Kette) • Unterschiedliche Anordnung von Genen je nach Antigenspezifität -> somatische Rekombination auf DNA Ebene • Ähnlichkeit im Aufbau zu Immunglobulinen • Vorausgesagte Struktur der Kette:

14. Heutiger Stand Quelle: Janeway

15. Vielen Dank für die Aufmerksamkeit !