Tecniche cromatografiche

1. Tecniche cromatografiche

2. Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico RIVELATORE

3. Valvola di ritegno a sfera Pompa alternativa a pistone Vantaggi: • Robustezza • Pressioni in uscita molto elevate (fino a 700 bar) • Volume interno ridotto (50 µl) -> adatte all’utilizzo in gradiente • Flussi costanti

4. Valvole di iniezione L’interfaccia universalmente utilizzata per introdurre il campione è la valvola a 6 (o 7) vie. A seconda del loopmontato varia il volume del campione iniettato in colonna

6. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) • Elevato numero di piatti teorici • Ridotta dimensione delle particelle di matrice • Elevata retropressione della colonna

7. Colonne per HPLC Pressione fino a 55 MPa (550 Bar)

8. Rivelatori • Sensibilità adeguata al problema • Buona stabilità e riproducibilità • Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza • Tempi di risposta rapidi • Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti

9. Rivelatore a indice di rifrazione Il rivelatore a indice di rifrazione misura la differenza nell’indice di rifrazione tra la cella del campione e una cella di riferimento che generalmente contiene soltanto l’eluente. Si utilizza un fascio di luce collimato e filtrato per rimuovere la luce IR che riscalderebbe il campione. Quando l’eluente contenente l’analita entra nella cella del campione, il raggio viene deflesso e inviato al fotodiodo producendo un segnale in uscita differente rispetto a quello prodotto dal solo eluente. Vantaggi e svantaggi È un rivelatore universale, cioè risponde a tutti i composti. Si utilizza per analiti che non assorbono in UV (es. idrocarburi saturi, alcool, eteri) Svantaggi: è poco sensibile, non è compatibile con gradiente di eluizione ed è sensibile a variazioni di p e T.

10. Rivelatore UV a l fissa La radiazione proveniente da una lampada a vapori di Hg passa attraverso la cella del campione e arriva al fotodiodo. L’intensità della luce assorbita è proporzionale alla concentrazione dell’analita. Vantaggi e svantaggi Il principale vantaggio è il basso costo. Inoltre l’elevata intensità della radiazione della lampada a Hg permette di ottenere elevata sensibilità per composti che assorbono a 254 nm. Il principale svantaggio è determinato dalla scarsa selettività dovuta alla necessità di lavorare a l fissa.

11. Il rivelatore UV a l variabile è sicuramente quello maggiormente utilizzato in HPLC. La luce UV proveniente dalla lampada a D2 e scissa nelle sue componenti attraverso un monocromatore a gradini. L’intensità della luce trasmessa è misurata attraverso un fotodiodo ed è proporzionale alla concentrazione dell’analita • Vantaggi • Versatilità: possibilità di selezionare l da 190 a 800 nm. • Elevata sensibilità: potendo scegliere la l ottimale (max assorbanza) per un analita. • Selettività: quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la l in modo tale da minimizzare l’assorbimento degli interferenti. • Possibilità di utilizzare gradiente di eluizione, scegliendo una l alla quale la miscela solvente non assorbe.

12. Rivelatore UV a diode array Il rivelatore UV a l diode array è quello che attualmente viene sempre più utilizzato in HPLC. La luce UV proveniente dalla lampada a D2 passa attraverso una cella a flusso prima che venga scissa nelle sue componenti attraverso un monocromatore a gradini. L’intensità della luce trasmessa ad ogni l è misurata simultaneamente attraverso un array di alcune centinaia di fotodiodi. Un pc può processare, registrare e mostrare gli spettri in continuo durante l’analisi. Inoltre si possono registrare i cromatogrammi a ciascuna l. Vantaggi e svantaggi Presenta gli stessi vantaggi in termini di versatilità, sensibilità e selettività del rivelatore a l variabile. Fornendo anche gli spettri degli analiti, permette di effettuare anche il riconoscimento dei composti analizzati. Svantaggio: è più costoso rispetto al rivelatore a l variabile.

13. Rivelatore a Fluorescenza La luce UV proveniente da una lampada (filtrata alla opportuna λ) o da un laser, passa attraverso la cella a flusso. Quando un campione fluorescente passa attraverso la cella, assorbe la radiazione, viene eccitato e quindi emetterà la radiazione di fluorescenza ad una maggiore λ. L’intensità della luce emessa viene misurata attraverso un fotomoltiplicatore posto a 90° rispetto al fascio incidente. Vantaggi e svantaggi È un rivelatore molto sensibile, ma risponde soltanto ai pochi analiti fluorescenti. Per aumentarne l’applicabilità si possono legare covalentemente dei marker fluorescenti. Questa derivatizzazione può essere fatta o prima della separazione o post-colonna aggiungendo i reattivi marcanti tra la colonna e il rivelatore.

14. Cromatografie di ripartizione • Fase diretta (fase staz. polare, eluente apolare) • Fase inversa (fase staz. apolare, eluente polare) Si – O – C18H37

15. RPC – Eluizione in gradiente acqua – CH3CN

16. Gel filtrazione • L’interazione avviene tra la proteina e la matrice polimerica. • La matrice polimerica è fatta di microsfere con porosità controllata. • Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensione. • Se una proteina, molto grande, non interagisce con la matrice esce con un volume di eluente pari al Void Volume (volume vuoto).

17. Gel filtrazione

18. Gel filtrazione

19. Gel filtrazione • Vantaggi • Semplice • Prevedibile • Svantaggi • Bassa capacità (piccoli volumi) • Soluzioni non viscose

20. Gel filtrazione

21. Determinazione peso molecolare Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL: 40,000 Da (40KDa)

22. Cromatografie di adsorbimento • Interazione idrofobica • Scambio ionico • Per affinità • Affinità per ligandi (anticorpi) • Proteine ingegnerizzate (His-tag) • Immobilized Metal ion Affinity Chromatography

23. Coefficiente di partizione - a • Il coefficiente di partizione tra le due fasi, a, è definito come il rapporto tra il soluto adsorbito sulla fase stazionaria rispetto a quello in soluzione nella fase mobile. a = 0 nessun adsorbimento a = 1 tutto adsorbito

24. Cromatografia di scambio ionico • Scambio anionico • A pH maggiore del pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico. • L’eluizione avviene con [Cl-] crescente o abbassando il pH (più difficile da controllare). • Scambio cationico • A pH minore del pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico. • L’eluizione avviene con [Na+] crescente o alzando il pH.

25. Scambiatori ionici

26. Cromatografia di scambio ionico

29. VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali. Cromatografia di scambio ionico