Activaci n transcripcional y uni n al adn por el factor eritroide gf 1 nf e1 eryfl
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Activación transcripcional y unión al ADN por el factor eritroide GF-1/ NF-E1/ Eryfl. David J.K Martin and Stuart H. Orkin. Genes and Development. 1990. INTRODUCCIÓN.

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Activaci n transcripcional y uni n al adn por el factor eritroide gf 1 nf e1 eryfl

Activación transcripcional y unión al ADN por el factor eritroide GF-1/ NF-E1/Eryfl

David J.K Martin and Stuart H. Orkin.

Genes and Development. 1990.


Introducci n
INTRODUCCIÓN

  • Los elementos en cis de ADN involucrados en la expresión génica de las células eritroides apropiada para el momento del desarrollo están dentro de los promotores, los intrones, enhancers 3´ de los genes de la globina, y en las regiones hipersensitivas a DNasaI.

  • La presencia de la secuencia consenso [(T/A)GATA(A/G)] en la mayoría de los elementos en cis de la globina y otros genes de células eritroides es un hecho consistente.


  • El factor eritroide, llamado GF-1, reconoce específicamente el motivo GATA.

  • Ha sido observado en todos los estados del desarrollo.

  • Las estructura primaria del ratón, humano, pollo y sapo han sido determinadas: 2 dominios novedosos de unión al ADN de esta configuración: Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys.

  • Esta estructura recuerda a la de los dedos de Zn. Los dos dedos son bastante similares en la secuencia de AA, pero hay diferencias entre ellos que están conservadas.


  • Faltan evidencias directas de que las proteínas el motivo eritroides que se unen a los motivos GATA estén implicadas en la activación transcripcional de los genes de la globina y otros genes eritroides.

  • Como se encontró que GF-1 se expresa en 2 líneas hematopoyéticas adicionales que están emparentadas con las células eritroides, se sospecha que GF-1 podría actuar en combinación con otros factores estableciendo los patrones de expresión génica específicos de cada línea.

  • Algunos estudios han llevado a pensar que GF-1 es esencial para el desarrollo de la línea eritroide.


Objetivos
Objetivos el motivo

  • Se realizó un análisis estructural-funcional con dos objetivos:

    1) Evaluar el potencial de GF-1 como activador transcripcional

    2) Examinar las popiedades y el rol de los dominios de dedo de GF-1 en la unión al ADN.


Resultados

RESULTADOS el motivo


1 activaci n transcripcional por mgf 1
1) Activación transcripcional por mGF-1 el motivo

1.a) Actividad en células transfectadas no eritroides:

  • Se cotransfectó ADNc de GF-1 expresable con varios plásmidos reporteros en líneas celulares no eritroides.


Plasmido Pxm-GF1: el motivo

  • Gen de la alfa1globina de ratón con promotor de la gamma globina humana unido al gen de la hormona de crecimiento humana o al gen de la beta globina humana.

  • Insertado en céluas renales de mono (COS), células NIH-3T3 de ratón y células humanas HeLa (células inmortales derivadas de tumor cervical)



  • Luego se examinó trans-activación de el motivo promotores artificiales.

  • Promotor artificial: 6 copias de sitio de unión a GF-1 del promotor del gen α1- globina de ratón que fueron introducidas en –44 del promotor β-globina humana; fue cotransfectado en cél.s NIH3T3 de ratón con el pXM-GF-1 o pXM con una forma GF-1 incapaz de dirigir proteína salvaje GF-1.

pXM + GF-1 D193(inactivo)

pXM- GF-1

Cotransferidos a CELULAS NIH -3T3


Ensayo de protecci n a la arnasa
Ensayo de protección a la el motivo ARNasa

  • RNA (de reticulocito humano)

  • tRNA

  • b44 + wild-tipe GF1

  • b44 globine + plasmido de expresion ADNc GF1 Δ193 (inactiva)

  • M6a-b44 + wild-tipe GF-1

  • M6a-b 44 + Δ193

La flecha indica un fragmento

De b-RNA corectamente iniciado



ENSAYO CUANTITATIVO: de las secuencias

  • Se generaron plásmidos con la hormona de crecimiento como reportera.

  • Plásmidos con una forma truncada del promotor β-globina de conejo sin ningún sitio de union adicional, con 1 sitio para Sp1 o con 1 o 6 sitios GF-1 se cotransfectaron con pXM o pXM-GF-1 en cél.s COS.


Transactivaci n en c lulas cos
Transactivación en células COS de las secuencias

Coexpresión de GF-1 salvaje llevó a una apreciable transactivación de M1α -GH y M6α-GH pero no llevó a la activación de promotores sin sitios de unión a GF-1


Transactivaci n en c lulas nih 3t3
Transactivación en células NIH-3T3 de las secuencias

Expresión de GF-1 humano llevó a la trans-activación de cél.s NIH3T3

Cotransfección de minifactor sin AA N-terminal a 194 y C-terminal a 308 falló en activar la transcripción


Entonces... de las secuencias

El GF-1 de ratón o humano expresado puede servir como potente activador en varias células no eritroides, pero sólo en el contexto de promotores mínimos conteniendo sitios de reconocimiento específicos.

  • En los estudios no se vio gran diferencia entre la transactivacion de reporteros conteniendo uno o varios sitios de union.

  • En nivel de GF-1 en las celuas COS es mayor que en 3T3. Esto sugiere que el ambiente en el que son introducidas es importante.


1.b) de las secuencias Localización de múltiples dominios de activación

  • Para mapear regiones de m-GF-1 responsables de la unión al ADN y la activación transcripcional se construyeron mutantes con deleciones del ADNc salvaje en el vector pXM y se cotransfectaron con M1α-GH o M6α-GH como reporteros en cél.s COS y 3T3.

  • La transfección de todos los mutantes a las cél.s COS llevó a producir abundante proteína que se une a los sitios GATA.

    Se concluyó que los AA N-term. a 193 y C-term. a 308 son dispensables para la unión al ADN pero no para la activación transcripcional.



  • Deleciones N-term. delimitan una región: los primeros 63 AA, requerida para la transactivación en cél.s COS y 3T3. La remoción del fragmento N-term de 22 AA sólo parcialmente reduce la transactivación.

  • Un segundo dominio de activación es revelado por las deleciones N-term: 149-188 y 64-193. Un tercer dominio es revelado por las deleciones C-term 308-413, 328-382,383-413, 349-413.

  • A diferencia de las regiones N-term, las C- term a los dominios de unión son dispensables usando M6α–GH pero no M1α–GH.


Entonces, el dominio AA, requerida para la transactivación en cél.s COS y 3T3. La remoción del fragmento N-term de 22 AA sólo parcialmente reduce la transactivación.N-term de GF-1 es necesario y suficiente para la activación transcripcional. Dominio C-term no lleva a la transactivación, por eso no puede activar independientemente y es sólo condicionalmente necesario para la activación.

  • Diferencias entre los dominios necesarios para la activación fueron establecidas observando la habilidad de dominios N-term y C-term al funcionar independientemente estando fusionados a dominios de unión al ADN heterólogos.

  • Segmentos de GF-1 fueron unidos al dominio de unión al ADN de GAL4 en PSG424 y cotransfectados a cél.s COS con un plásmido reportero con un promotor mínimo con 5 sitios de unión GAL4, llevando a la expresión de CAT.

  • El fragmento N-term 66 de GF-1llevó a aumentar 29 veces la expresión de CAT, el fragmento entero N-term confiere un aumento de 6 veces.



2 uni n al adn por mgf 1 interacciones cooperativas entre dominios dedo de uni n
2) Unión al ADN por mGF-1: un stio de unión de ADN heterólogo.Interacciones cooperativas entre dominios dedo de unión

  • Investigación del rol individual de cada dominio de unión al ADN

    Deleciones o sustituciones de a.a únicos en

    cada dominio y sus efectos.

2.a) La mutación del dedo amino reduce la estabilidad de unión al ADN

2.b) La mutación del dedo carboxilo afecta la afinidad de unión al ADN.


2 a la mutaci n del dedo amino reduce la estabilidad de uni n al adn
2.a) un stio de unión de ADN heterólogo. La mutación del dedo amino reduce la estabilidad de unión al ADN

  • La deleccion del dedo amino o la sustitución C261P impidió la unión al ADN.

  • Sólo los mutantes que sí unieron al ADNLa deleción del dedo amino o la sustitución C207P no previene la unión activaron la transcripción.

  • C261P = rol crítico de residuos de cisteína.



  • DNasa I footprinting: un stio de unión de ADN heterólogo.

    • -no muestra diferencias entre GF-1 WT y mutante sin dedo amino.

  • Ensayo interferencia por metilación:

    • - Δ200-248 sólo contacta el motivo distal

    • - Δ200-248 presenta especificidad de unión menor a WT.

Mutante sin dedo amino une al ADN, pero existen alteraciones en sus propiedades de unión... i) Especificidad:


Dnasa I FOOTPRINTING un stio de unión de ADN heterólogo.

INTERFERENCIA POR METILACIÓN

Figura 5. DNAsaI footprinting y ensayo de interferencia por metilación en mutante Δ200-248


Mutante sin dedo amino une al ADN, pero existen alteraciones en sus propiedades de unión... ii) Estabilidad:

  • La unión de Δ200-248 al ADN es inestable en comparación con la unión por la proteína salvaje. (más inestable aún cuando el ADN tiene 2 motivos GATA)

  • C207P presenta misma tasa de disociación que Δ200-248 = rol crítico de cisteína en función.


Figura 6. Unión inestable al ADN por en sus propiedades de unión...Δ200-248


En suma: en sus propiedades de unión...

  • Dedo amino es necesario para una completa especificidad y estabilidad en la unión al ADN por GF-1.

  • Este rol es más importante en la unión a 2 sitios en lugar de a uno solo.


2 b la mutaci n del dedo carboxilo afecta la afinidad de uni n al adn
2.b) en sus propiedades de unión... La mutación del dedo carboxilo afecta la afinidad de unión al ADN.

100 ng 40 ng 20 ng 10 ng

  • (Mutante sin dedo C-term y C261P = indispensables para unión al ADN)

  • Mutante L284F (C-term)

    • -Mucha menor afinidad de unión que GF-1 salvaje (10x).

    • -Estabilidad (tasa de disociación) normal (no se muestra)

  • Mutante L230F (N-term)

    • 2 veces menor afinidad de unión que GF-1 salvaje

    • Estabilidad reducida.

Figura 7. Afinidad de unión al ADN reducida del mutante L284F(1er West xa confirmar q extrac tuvieran cant eq. Gf-1)


Hasta aquí: en sus propiedades de unión...

  • Mutaciones que remueven o alteran el dedo amino (Δ200-248, C207P, L234F) disminuyen estabilidad de la unión al ADN.

  • Mutaciones en dedo carboxilo previenen (Δ249-290, C261P) o reducen (L284F) la afinidad de unión al ADN.

Dedo C-term. Define unión y afinidad.

Dedo N-term. Define especificidad y estabilidad.


La transactivación por parte de los mutantes de dedos de unión en células COS, no está estrictamente correlacionada con la unión al ADN...

  • Transactivación normal en Δ200-248 y C207P, a pesar de tener estabilidad de unión reducida

    • Podría ser consecuencia de saturación del ADN (sitios de unión a reportera) por proteínas altamente expresadas en células COS.

    • En células 3T3 la activación se reduce en 50-75%.


Entonces: la unión en células COS, no está estrictamente correlacionada con la unión al ADN...afinidad en la unión al ADN es el principal determinante de la activación (y no la estabilidad) como medida de ensayo por cotransfección.

La transactivación por parte de los mutantes de dedos de unión en células COS, no está estrictamente correlacionada con la unión al ADN...

  • Transactivación por L230F es afectada sólo mínimamente

  • Transactivación por L284F se ve reducida sustancialmente


En suma
En suma: unión en células COS, no está estrictamente correlacionada con la unión al ADN...

  • Los dos dedos de unión son funcionalmente distintos.

  • El dedo carboxilo es necesario para la unión.

  • El dedo amino es necesario sólo para una completa especificidad y estabilidad en la unión.

  • El rol de cada dedo es más pronunciado con algunos sitios de unión que con otros.

  • Los efectos en la activación transcripcional no están estrictamente correlacionados con los efectos en la unión al ADN.


Discusi n

DISCUSIÓN unión en células COS, no está estrictamente correlacionada con la unión al ADN...


1 gf 1 como un activador transcripcional
1) GF-1 como un activador transcripcional unión en células COS, no está estrictamente correlacionada con la unión al ADN...

  • mGF-1 es un potente activador transcripcional en experimentos de cotransfección con promotores artificiales en un ambiente celular heterólogo. La transactivación es dependiente de los sitios GATA pero no muy influenciada por el nº relativo de sitios en el promotor mínimo. Esto puede reflejar la saturación en el inicio de la transcipción.

  • Los análisis mutacionales definen: un dominio de 66 AA, N-term., ácido, rico en serina que es necesario para la activación.


  • El dominio N-term puede servir como activador cuando es aislado de otras regiones de GF-1, pero igual necesita otras regiones para la actividad completa.

  • Esto implica que debe haber una conformación particular de la proteína para establecer apropiadas interacciones proteína-proteína en el complejo transcripcional.


Que existan aislado de otras regiones de GF-1, pero igual necesita otras regiones para la actividad diferencias en la activación transcripcional por GF-1 envarios ambientes celulares es sugerida por:

  • Hay poca o ninguna transactivación de los promotores mín. introducidos en cél.s MEL (cantidad intermedia de GF-1). Esto coincide con que uniendo sitios GATA a promotores –γ humanos truncados o promotores α-1globina de ratón no aumenta la expresión eritroide en reporteros unidos.

  • La arquitectura del promotor debe de ser crítica para la función de GF-1 en un ambiente celular eritroide, quizás menos en cél.s heterólogas con el promotor mínimo.

  • Las interacciones de proteínas nucleares con GF-1 unido al ADN no parecen ser productivas dentro de las cél.s MEL.

  • El apreciable menor nivel de transactivación por GF-1 en cél.s COS, comparado con 3T3 ilustra directamente la influencia con el ambiente celular.


2 nuevos aspectos acerca del dominio de uni n al adn del factor eritroide

GF-1 (ratón y pollo): fundadores de una aislado de otras regiones de GF-1, pero igual necesita otras regiones para la actividad nueva familia de proteínas de unión al ADN mediante dedos de Zn

Proteínas de unión a GATA

2) Nuevos aspectos acerca del dominio de unión al ADN del factor eritroide


Nt aislado de otras regiones de GF-1, pero igual necesita otras regiones para la actividad

Ct

Figura 8. Conservación de secuencia primaria de los dominios de dedo de proteínas de unión a GATA.

  • Estructura Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys recuerda a la de otras familias de proteínas con dedos de Zn.

  • Sin embargo, presentan una extraordinaria conservación en secuencia primaria nueva familia.

    • Proteínas de un dedo

    • Proteínas de dos dedos (GF-1/Eryf 1)


  • Hipótesis aislado de otras regiones de GF-1, pero igual necesita otras regiones para la actividad : diferencias en a.a de los dedos de distintas proteínas podrían servir para reconocer diferencialmente motivos GATA núcleo según sus secuencias circundantes.

  • Evidencias:

    • -Eryf 1 de pollo no reconoce todas las secuencias consenso con la misma eficiencia.

    • -Una proteína une a GATA en un determinado promotor, pero no reconoce eficientemente otros.

  • Para futuras evidencias: Comparación entre distintos miembros de la familia GATA y mutagénesis específica de sitio.


Nt aislado de otras regiones de GF-1, pero igual necesita otras regiones para la actividad

Ct

Figura 8. Conservación de secuencia primaria de los dominios de dedo de proteínas de unión a GATA.

  • Conservación de diferencias en secuencia de a.a. entre los 2 dedos de proteínas de unión a GATA de vertebrados

  • Dedo carboxilo de las proteínas de 2 dedos es muy similar al dedo de proteínas de hongos y levaduras (no tanto dedo amino)

Hipótesis: los 2 dedos de proteínas de eucariotas superiores podrían haber evolucionado para cumplir diferentes funciones


  • Según resultados... aislado de otras regiones de GF-1, pero igual necesita otras regiones para la actividad

  • GF-1 cooperación entre dedos estabilidad

  • especificidad

  • Rol del dedo amino es mayor cuando GF-1 une a 2 sitios GATA simultaneamente.

  • Dedo amino también debe interaccionar directamente con el ADN.


Hipótesis: los 2 dedos de proteínas de eucariotas superiores podrían haber evolucionado para cumplir diferentes funciones

  • ¿Cómo?: Por duplicación del dedo carboxilo

  • - conservación con proteínas hongos y levaduras

  • - esencial para la unión

  • Ventajas de permanencia de este evento:

  • - cooperación en unión al ADN

  • - aumento en variedad de sitios de unión reconocidos

  • Cooperación entre dedos de Zn con funciones diferentes y análogas a GF-1 también en otras proteínas (superfamilia receptores esterodies)


  • En este estudio superiores podrían haber evolucionado para cumplir no se reveló un desacoplamiento entre la unión al ADN y la activación, como sí ocurrió con otras proteínas en otros trabajos.

    • - se vio que activación y unión no están estrictamente correlacionadas, pero las mutaciones en dominios de unión que afectaban activación también afectaban unión.


  • Según resultados... superiores podrían haber evolucionado para cumplir

  • Interacciones complejas entre dominios de unión y ADN blanco cómo podrían influir en la función de GF-1 en la regulación de genes durante el desarrollo celular:

    • Activación por GF-1 in vivo podría depender del tipo de sitio al cual se une (complejo transcripcional).

    • La ocupación de diferentes tipos de sitios de unión GATA variaría según la concentración de GF-1: activación génica diferencial dependiente de concentración (desarrollo eritroide, bicoid en Drosophila)


  • ¿Cómo puede un único factor participar en la compleja y programada regulación de tanta diversidad de genes?

  • Combinaciones diferentes de sitios de unión GATA y sitios de unión para otras proteínas

  • Modificación de propiedades de unión y activación de factores de transcripción por splicing alternativo o modificación post transcripcional.

  • Múltiples dominios de activación, cualitativamente diferentes, para gran variedad de interacciones con diferentes proteínas (diferentes células y estados desarrollo)

  • Naturaleza de los dominios de dedo y la influencia de la estructura y secuencia de sitios de unión unión al ADN finamente regulada

El número de factores de transcripción específicos de célula requeridos para establecer una expresión génica linaje específica, podría ser menor al esperado hasta ahora.

Ventajas biológicas de un factor de transcripción complejo


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