wsp czesne metody analiz genetycznych
Download
Skip this Video
Download Presentation
Współczesne metody analiz genetycznych

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 43

Wsp lczesne metody analiz genetycznych - PowerPoint PPT Presentation


  • 213 Views
  • Uploaded on

Współczesne metody analiz genetycznych . Anna Jakubowska. Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM. Genom. Chromosom. Gen. Gen. Region międzygenowy. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_genome_to_genes.png. Poznanie genomu człowieka.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Wsp lczesne metody analiz genetycznych' - corby


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
wsp czesne metody analiz genetycznych

Współczesne metody analiz genetycznych

Anna Jakubowska

Katedra Onkologii

Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM

slide2

Genom

Chromosom

Gen

Gen

Region międzygenowy

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_genome_to_genes.png

slide3

Poznanie genomu człowieka

  • rozpoczęcie HGP – 1990 (Human Genome Project)
  • wstępny opis sekwencji – 2000

(Venter et al., Science 2001; Lander et al., Nature 2001)

  • zakończenie sekwencjonowania – 2003
  • oficjalne zakończenie HGP – 2004 (International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 2004 )
slide4

Struktura genomu człowieka

  • 3 274 571 503 pz
  • ~ 2% to sekwencje kodujące
      • 21 911 genów kodujących białka
      • 8 483 genów kodujących RNA
      • 12 599 pseudogenów
  • ~ 98% to sekwencje niekodujące
      • introny oraz sekwencje międzygenowe
  • 23 326 320 SNPs(polimorfizmy pojedynczego nukleotydu)
  • ~ 8 400 regionów CNV (duplikacje lub delecje odcinków DNA o długości >500 zasad)

(http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable)

slide5

Geny

  • funkcja wielu genów wciąż niepoznana
  • identyfikacja genów lub specyficznych stref genetycznych związanych z rozwojem chorób:
      • badania asocjacyjne
      • sekwencjonowanie genomu
slide6

Badania asocjacyjne

  • analiza wybranych markerów –kandydatów
  • analiza markerów pokrywających cały genom, tzw. GWAS (Genome – Wide Association Study) potocznie nazywana skanowaniem genomu
slide7
GWAS

Badanie „przypadek - kontrola” („case - control”), w którym analizuje się związek pomiędzy występowaniem określonej cechy klinicznej a SNPs lub CNVs rozmieszczonymi w całym genomie

C

A

B

A

B

B

B

C

A

C

SNP

CNV

http://www.snipscreen.com/genetics.php

za o enia gwas
Założenia GWAS
  • badanie dużej liczby polimorfizmów o największej zmienności międzyosobniczej
  • badanie jak największej grupy osób chorych i zdrowych
slide9

Chorzy

Zdrowi

DNA

DNA

Porównanie

Identyfikacja SNP związanych z chorobą

http://cpmc.coriell.org/Sections/Medical/GeneInteraction_mp.aspx?PgId=93

badania gwas kluczowe zasady
Badania GWAS – kluczowe zasady
  • homogenność grupy badanej pod względem analizowanej cechy
  • liczna grupa kontrolna oraz badana
  • walidacja
slide11

Etapy GWAS

Badane SNPs

Przypadki i kontrole

I etap

II etap

III etap

Mapowanie zmian

Analiza funkcjonalna

Garcia-Closas M , Chanock S Clin Cancer Res 2008;14:8000-8009

http://clincancerres.aacrjournals.org/content/14/24/8000/F3.expansion.html

©2008 by American Association for Cancer Research

polimorfizmy dla gwas
Polimorfizmy dla GWAS
  • wysoka częstość, MAF (minor allele frequency) >5%
      • ~7 mln SNP o częstości MAF >5%
      • ~4 mln SNP o częstości 1-5%
  • brak sprzężenia

SNP nie powinny znajdować się w genomie blisko siebie w tzw. nierównowadze sprzężeń (linkage disequilibrium)

  • wykorzystanie mikromacierzy
      • Affymetrix
      • Illumina
projekt hapmap
Projekt HapMap
  • międzynarodowe przedsięwzięcie obejmujące Japonię, Kanadę, Chiny, Nigerię i USA w celu identyfikacji oraz określenia częstości zmian polimorficznych w genomie ludzkim w różnych populacjach
  • 270 osób:
    • 90 z Nigerii
    • 45 z Japonii
    • 45 z Chin
    • 90 z Europy północnej i zachodniej
analiza mikromacierzy
Analiza mikromacierzy
  • wytworzenie mikromacierzy

naniesienie na płytkę gotowych lub zsyntetyzowanych in situ sond długości 25 - 70 nukleotydów

mikromacierz

Sonda oligonukleotydowa

http://www.affymetrix.com

analiza mikromacierzy1
Analiza mikromacierzy
  • hybrydyzacja DNA na płytce zawierającej sondy

http://www.affymetrix.com

analiza mikromacierzy2
Analiza mikromacierzy
  • skanowanie

http://www.affymetrix.com

analiza mikromacierzy3
Analiza mikromacierzy
  • analiza ilościowa
analiza mikromacierzy4
Analiza mikromacierzy
  • Affymetrix
  • Illumina
affymetrix
Affymetrix
  • „chip”

Affymetrix\'s Genome-Wide Human SNP Array 6.0 zawiera sondy dla 906 600 SNP i 946 000 CNV

  • strategia wyboru SNP:

tylko połowa w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging „tagSNPs”, reszta to dowolne SNPs występujące w genomie

  • sondy

25-nukleotydowe, 4-6 kopii/zmianę

  • detekcja

hybrydyzacja wyznakowanego DNA

slide20

Trawienie enzymami restrykcyjnymi

Ligacja z adapterem Nsp lub Sty

Amplifikacja PCR z jednym starterem

Oczyszczenie próbki

Fragmentacja, znakowanie końców

Hybrydyzacja

http://www.affymetrix.com/estore/browse/products.jsp?categoryIdClicked=&productId=131534#1_1

illumina
Illumina
  • „chip”

HumanOmni2.5-Quad BeadChip zawiera > 2.45 milliona sond do badania SNPs i CNVs

  • strategia wyboru SNPs:

w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging „tagSNPs”

  • sondy

50-nukleotydowe, 1/zmianę

  • detekcja

wydłużanie sond z dobudowaniem znakowanych nukleotydów

slide22

Genomowe DNA

(200 - 400 ng)

Amplifikacja DNA

Fragmentacja DNA

2-etapowa detekcja

Etap I

Hybrydyzacja DNA z sondą

Wydłużanie sond z dobudowaniem wyznakowanych nukleotydów

Etap II

http://www.illumina.com/technology/infinium_hd_assay.ilmn

zestawienie wykonanych gwas
Zestawienie wykonanych GWAS
  • ~ 600 GWAS obejmujących różne grupy i populacje
  • 150 różnych zespołów np. cukrzyca typu I i II, choroba Crohna, choroba Alzheimera, schizofrenia, udar, choroby serca, nowotwory złośliwe, otyłość
  • > 50 000 SNP wyselekcjonowanych do walidacji
  • zidentyfikowano ~800 SNP związanych z chorobami (p<5×10-8)

Johnson and O\'Donnell, BMC Medical Genetics 2009

Manolio, NEJM 2010

badanie wellcome trust 2005 2007
Badanie Wellcome Trust 2005-2007
  • 8 ważnych schorzeń wieloczynnikowych
  • 19 000 osób (chorych i zdrowych)
  • 500 000 polimorfizmów (SNPs i CNVs)
  • 200 badaczy,
  • 9 milionów funtów

https://www.wtccc.org.uk/ccc1/

Nature 2007, Nature 2010

wyniki bada wellcome trust
Wyniki badań Wellcome Trust
  • Choroba afektywna dwubiegunowa

locus 16p12 (OR 2,08)

  • Choroba wieńcowa

locus 9p21 (ORhet-hom 1,47-1,9)

  • Choroba Crohna
    • 5 znanych lokalizacji (ORhet-hom): NOD2 (1,29-1,92), IL23R (1,39-1,86), ATG16L1 (1,19-1,85), ZNF365 (1,23-1,55), locus 5p13.1 (1,54-2,32)
    • 4 nowe lokalizacje (ORhet-hom): IRGM (1,54-1,92), BSN (1,09-1,84), NKX2-3 (1,2-1,62), PTPN2 (1,3-2,01)
wyniki bada wellcome trust1
Wyniki badań Wellcome Trust
  • Nadciśnienie

brak wyraźnych czynników ryzyka - kilka wariantów o stosunkowo małym wpływie (OR 0,97-1,6)

  • Reumatoidalne zapalenie stawów
    • 9 znanych już lokalizacji (OR 0,91-2,3)
    • PTPN22 (ORhet-hom 1,98-3,32), region MHC (ORhet-hom 2,36-5,21)
    • korelacja z chorobami serca i cukrzycą typu I
wyniki bada wellcome trust2
Wyniki badań Wellcome Trust
  • Cukrzyca typu I
    • 5 znanych lokalizacji, w tym gen PTPN22 (ORhet-hom 1,82-5,19) i MHC (ORhet-hom 5,49-18,52)
    • 3 nowe loci (ORhet-hom ): 12q13 (1,34-1,75), 12q24 (1,34-1,94), 16p13 (1,19-1,55)
  • Cukrzyca typu II

TCFL2 (ORhet-hom 1,36-1,88), FTO (ORhet-hom 1,34-1,55), CDKAL1/CDKARAP1 (ORhet-hom 1,18-2,17)

znaczenie medyczne
Znaczenie medyczne
  • identyfikacja grup zwiększonego ryzyka zachorowania na określone choroby
    • związek z pojedynczym markerem, tzw. „single effect”
    • sumowanie ryzyka, tzw. „additive effect”

np. OR 1,62 (1 SNP) i OR 9,46 (≥5 SNPs) dla raka prostaty

Pharoah et al. NEJM 2008

Zheng et al. NEJM 2008

slide30

Zmiany zidentyfikowane w GWAS

  • funkcjonalne
  • niefunkcjonalne
    • markery genetyczne
    • identyfikują obszar/gen gdzie należy szukać właściwych mutacji
slide31

Sekwencjonowanie DNA

Technika umożliwiająca ustalenie kolejności zasad w DNA.

slide32
Sangera – 1975 rok

polega na terminacji łańcucha DNA przy wykorzystaniu zmodyfikowanych nukleotydów (dideoksynukleotydy)

Maxama-Gilberta – 1977 rok

polega na wykorzystaniu związków chemicznych do rozszczepiania łańcucha DNA

slide33
automatyczne – 1987 rok

oparte na metodyce Sangera

http://www.answers.com/topic/dna-sequencing

http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=225046&tabno=2

slide34
3730xl DNA Analyzer

96 kapilar

3 840 próbek/dobę

2 100 000 zasad/dobę

do 900 zasad/próbkę

http://www.mun.ca/biology/scarr/4241_RMC_Sequencing.html

slide35
pirosekwencjonowanie – 1996 rok

„sekwencjonowanie poprzez syntezę”

w reakcji wykorzystywane są cztery enzymy:

fragment Klenowa polimerazy DNA I

sulfurylaza ATP

lucyferaza

apiraza.

http://www.translational-medicine.com/content/1/1/9/figure/F5?highres=y

slide36
PyroMark Q96 MD

do 96 próbek analizowanych jednocześnie

max. 300 - 500 zasad/próbkę

do 960 próbek/dobę

krótka procedura przygotowania próbek

sekwencjonowanie nowej generacji
Sekwencjonowanie nowej generacji

Analiza setek milionów lub miliardów par zasad w jednym ciągu reakcji, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów

System 454 (Roche)

HiSeq (Illumina)

SOLiD (Applied Biosystems)

system 454
System 454

w oparciu o pirosekwencjonowanie

>1mln zasad/analizę

1 mld zasad/dobę

do 450 zasad/próbkę

czułość 99%

koszt 7 000 $/analizę

hiseq2000
HiSeq2000

w oparciu o odwracalną reakcję terminacji

jednoczesna analiza dwóch różnych próbek

200 mld zasad/analizę, 8 dni

do 25 mld zasad/dobę

do 100 zasad/próbkę

czułość >99%

koszt 10 000 $/analizę

5500xl solid system
5500xl SOLiD™ System

w oparciu o ligację komplementarnych frag.

jednoczesna analiza 12 różnych próbek

300 mld zasad/analizę, 7 dni

do 45 mld zasad/dobę

do 75 zasad/próbkę

czułość 99.99%

koszt 6 000 $/analizę

podsumowanie
Podsumowanie
  • najlepsze efekty daje połączenie kilku metod
  • konieczne nowej jakości badania strukturalne i asocjacyjne :
    • RNA
    • białek
    • innych oddziaływań ze środowiskiem o nieznanym dotąd charakterze
ad