Wsp czesne metody analiz genetycznych
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 43

Współczesne metody analiz genetycznych PowerPoint PPT Presentation


  • 157 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Współczesne metody analiz genetycznych . Anna Jakubowska. Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM. Genom. Chromosom. Gen. Gen. Region międzygenowy. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_genome_to_genes.png. Poznanie genomu człowieka.

Download Presentation

Współczesne metody analiz genetycznych

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Wsp czesne metody analiz genetycznych

Współczesne metody analiz genetycznych

Anna Jakubowska

Katedra Onkologii

Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM


Wsp lczesne metody analiz genetycznych

Genom

Chromosom

Gen

Gen

Region międzygenowy

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_genome_to_genes.png


Wsp lczesne metody analiz genetycznych

Poznanie genomu człowieka

  • rozpoczęcie HGP – 1990 (Human Genome Project)

  • wstępny opis sekwencji – 2000

    (Venter et al., Science 2001; Lander et al., Nature 2001)

  • zakończenie sekwencjonowania – 2003

  • oficjalne zakończenie HGP – 2004 (International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 2004 )


Wsp lczesne metody analiz genetycznych

Struktura genomu człowieka

  • 3 274 571 503 pz

  • ~ 2% to sekwencje kodujące

    • 21 911 genów kodujących białka

    • 8 483 genów kodujących RNA

    • 12 599 pseudogenów

  • ~ 98% to sekwencje niekodujące

    • introny oraz sekwencje międzygenowe

  • 23 326 320 SNPs(polimorfizmy pojedynczego nukleotydu)

  • ~ 8 400 regionów CNV (duplikacje lub delecje odcinków DNA o długości >500 zasad)

  • (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable)


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Geny

    • funkcja wielu genów wciąż niepoznana

    • identyfikacja genów lub specyficznych stref genetycznych związanych z rozwojem chorób:

      • badania asocjacyjne

      • sekwencjonowanie genomu


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Badania asocjacyjne

    • analiza wybranych markerów –kandydatów

    • analiza markerów pokrywających cały genom, tzw. GWAS (Genome – Wide Association Study) potocznie nazywana skanowaniem genomu


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    GWAS

    Badanie „przypadek - kontrola” („case - control”), w którym analizuje się związek pomiędzy występowaniem określonej cechy klinicznej a SNPs lub CNVs rozmieszczonymi w całym genomie

    C

    A

    B

    A

    B

    B

    B

    C

    A

    C

    SNP

    CNV

    http://www.snipscreen.com/genetics.php


    Za o enia gwas

    Założenia GWAS

    • badanie dużej liczby polimorfizmów o największej zmienności międzyosobniczej

    • badanie jak największej grupy osób chorych i zdrowych


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Chorzy

    Zdrowi

    DNA

    DNA

    Porównanie

    Identyfikacja SNP związanych z chorobą

    http://cpmc.coriell.org/Sections/Medical/GeneInteraction_mp.aspx?PgId=93


    Badania gwas kluczowe zasady

    Badania GWAS – kluczowe zasady

    • homogenność grupy badanej pod względem analizowanej cechy

    • liczna grupa kontrolna oraz badana

    • walidacja


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Etapy GWAS

    Badane SNPs

    Przypadki i kontrole

    I etap

    II etap

    III etap

    Mapowanie zmian

    Analiza funkcjonalna

    Garcia-Closas M , Chanock S Clin Cancer Res 2008;14:8000-8009

    http://clincancerres.aacrjournals.org/content/14/24/8000/F3.expansion.html

    ©2008 by American Association for Cancer Research


    Polimorfizmy dla gwas

    Polimorfizmy dla GWAS

    • wysoka częstość, MAF (minor allele frequency) >5%

      • ~7 mln SNP o częstości MAF >5%

      • ~4 mln SNP o częstości 1-5%

  • brak sprzężenia

    SNP nie powinny znajdować się w genomie blisko siebie w tzw. nierównowadze sprzężeń (linkage disequilibrium)

  • wykorzystanie mikromacierzy

    • Affymetrix

    • Illumina


  • Projekt hapmap

    Projekt HapMap

    • międzynarodowe przedsięwzięcie obejmujące Japonię, Kanadę, Chiny, Nigerię i USA w celu identyfikacji oraz określenia częstości zmian polimorficznych w genomie ludzkim w różnych populacjach

    • 270 osób:

      • 90 z Nigerii

      • 45 z Japonii

      • 45 z Chin

      • 90 z Europy północnej i zachodniej


    Analiza mikromacierzy

    Analiza mikromacierzy

    • wytworzenie mikromacierzy

      naniesienie na płytkę gotowych lub zsyntetyzowanych in situ sond długości 25 - 70 nukleotydów

    mikromacierz

    Sonda oligonukleotydowa

    http://www.affymetrix.com


    Analiza mikromacierzy1

    Analiza mikromacierzy

    • hybrydyzacja DNA na płytce zawierającej sondy

    http://www.affymetrix.com


    Analiza mikromacierzy2

    Analiza mikromacierzy

    • skanowanie

    http://www.affymetrix.com


    Analiza mikromacierzy3

    Analiza mikromacierzy

    • analiza ilościowa


    Analiza mikromacierzy4

    Analiza mikromacierzy

    • Affymetrix

    • Illumina


    Affymetrix

    Affymetrix

    • „chip”

      Affymetrix's Genome-Wide Human SNP Array 6.0 zawiera sondy dla 906 600 SNP i 946 000 CNV

    • strategia wyboru SNP:

      tylko połowa w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging „tagSNPs”, reszta to dowolne SNPs występujące w genomie

    • sondy

      25-nukleotydowe, 4-6 kopii/zmianę

    • detekcja

      hybrydyzacja wyznakowanego DNA


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Trawienie enzymami restrykcyjnymi

    Ligacja z adapterem Nsp lub Sty

    Amplifikacja PCR z jednym starterem

    Oczyszczenie próbki

    Fragmentacja, znakowanie końców

    Hybrydyzacja

    http://www.affymetrix.com/estore/browse/products.jsp?categoryIdClicked=&productId=131534#1_1


    Illumina

    Illumina

    • „chip”

      HumanOmni2.5-Quad BeadChip zawiera > 2.45 milliona sond do badania SNPs i CNVs

    • strategia wyboru SNPs:

      w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging „tagSNPs”

    • sondy

      50-nukleotydowe, 1/zmianę

    • detekcja

      wydłużanie sond z dobudowaniem znakowanych nukleotydów


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Genomowe DNA

    (200 - 400 ng)

    Amplifikacja DNA

    Fragmentacja DNA

    2-etapowa detekcja

    Etap I

    Hybrydyzacja DNA z sondą

    Wydłużanie sond z dobudowaniem wyznakowanych nukleotydów

    Etap II

    http://www.illumina.com/technology/infinium_hd_assay.ilmn


    Zestawienie wykonanych gwas

    Zestawienie wykonanych GWAS

    • ~ 600 GWAS obejmujących różne grupy i populacje

    • 150 różnych zespołów np. cukrzyca typu I i II, choroba Crohna, choroba Alzheimera, schizofrenia, udar, choroby serca, nowotwory złośliwe, otyłość

    • > 50 000 SNP wyselekcjonowanych do walidacji

    • zidentyfikowano ~800 SNP związanych z chorobami (p<5×10-8)

    Johnson and O'Donnell, BMC Medical Genetics 2009

    Manolio, NEJM 2010


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Manolio et al., NEJM 2010


    Badanie wellcome trust 2005 2007

    Badanie Wellcome Trust 2005-2007

    • 8 ważnych schorzeń wieloczynnikowych

    • 19 000 osób (chorych i zdrowych)

    • 500 000 polimorfizmów (SNPs i CNVs)

    • 200 badaczy,

    • 9 milionów funtów

    https://www.wtccc.org.uk/ccc1/

    Nature 2007, Nature 2010


    Wyniki bada wellcome trust

    Wyniki badań Wellcome Trust

    • Choroba afektywna dwubiegunowa

      locus 16p12 (OR 2,08)

    • Choroba wieńcowa

      locus 9p21 (ORhet-hom 1,47-1,9)

    • Choroba Crohna

      • 5 znanych lokalizacji (ORhet-hom): NOD2 (1,29-1,92), IL23R (1,39-1,86), ATG16L1 (1,19-1,85), ZNF365 (1,23-1,55), locus 5p13.1 (1,54-2,32)

      • 4 nowe lokalizacje (ORhet-hom): IRGM (1,54-1,92), BSN (1,09-1,84), NKX2-3 (1,2-1,62), PTPN2 (1,3-2,01)


    Wyniki bada wellcome trust1

    Wyniki badań Wellcome Trust

    • Nadciśnienie

      brak wyraźnych czynników ryzyka - kilka wariantów o stosunkowo małym wpływie (OR 0,97-1,6)

    • Reumatoidalne zapalenie stawów

      • 9 znanych już lokalizacji (OR 0,91-2,3)

      • PTPN22 (ORhet-hom 1,98-3,32), region MHC (ORhet-hom 2,36-5,21)

      • korelacja z chorobami serca i cukrzycą typu I


    Wyniki bada wellcome trust2

    Wyniki badań Wellcome Trust

    • Cukrzyca typu I

      • 5 znanych lokalizacji, w tym gen PTPN22 (ORhet-hom 1,82-5,19) i MHC (ORhet-hom 5,49-18,52)

      • 3 nowe loci (ORhet-hom ): 12q13 (1,34-1,75), 12q24 (1,34-1,94), 16p13 (1,19-1,55)

    • Cukrzyca typu II

      TCFL2 (ORhet-hom 1,36-1,88), FTO (ORhet-hom 1,34-1,55), CDKAL1/CDKARAP1 (ORhet-hom 1,18-2,17)


    Znaczenie medyczne

    Znaczenie medyczne

    • identyfikacja grup zwiększonego ryzyka zachorowania na określone choroby

      • związek z pojedynczym markerem, tzw. „single effect”

      • sumowanie ryzyka, tzw. „additive effect”

        np. OR 1,62 (1 SNP) i OR 9,46 (≥5 SNPs) dla raka prostaty

    Pharoah et al. NEJM 2008

    Zheng et al. NEJM 2008


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Zmiany zidentyfikowane w GWAS

    • funkcjonalne

    • niefunkcjonalne

      • markery genetyczne

      • identyfikują obszar/gen gdzie należy szukać właściwych mutacji


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Sekwencjonowanie DNA

    Technika umożliwiająca ustalenie kolejności zasad w DNA.


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    Sangera – 1975 rok

    polega na terminacji łańcucha DNA przy wykorzystaniu zmodyfikowanych nukleotydów (dideoksynukleotydy)

    Maxama-Gilberta – 1977 rok

    polega na wykorzystaniu związków chemicznych do rozszczepiania łańcucha DNA


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    automatyczne – 1987 rok

    oparte na metodyce Sangera

    http://www.answers.com/topic/dna-sequencing

    http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=225046&tabno=2


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    3730xl DNA Analyzer

    96 kapilar

    3 840 próbek/dobę

    2 100 000 zasad/dobę

    do 900 zasad/próbkę

    http://www.mun.ca/biology/scarr/4241_RMC_Sequencing.html


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    pirosekwencjonowanie – 1996 rok

    „sekwencjonowanie poprzez syntezę”

    w reakcji wykorzystywane są cztery enzymy:

    fragment Klenowa polimerazy DNA I

    sulfurylaza ATP

    lucyferaza

    apiraza.

    http://www.translational-medicine.com/content/1/1/9/figure/F5?highres=y


    Wsp lczesne metody analiz genetycznych

    PyroMark Q96 MD

    do 96 próbek analizowanych jednocześnie

    max. 300 - 500 zasad/próbkę

    do 960 próbek/dobę

    krótka procedura przygotowania próbek


    Sekwencjonowanie nowej generacji

    Sekwencjonowanie nowej generacji

    Analiza setek milionów lub miliardów par zasad w jednym ciągu reakcji, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów

    System 454 (Roche)

    HiSeq (Illumina)

    SOLiD (Applied Biosystems)


    System 454

    System 454

    w oparciu o pirosekwencjonowanie

    >1mln zasad/analizę

    1 mld zasad/dobę

    do 450 zasad/próbkę

    czułość 99%

    koszt 7 000 $/analizę


    Hiseq2000

    HiSeq2000

    w oparciu o odwracalną reakcję terminacji

    jednoczesna analiza dwóch różnych próbek

    200 mld zasad/analizę, 8 dni

    do 25 mld zasad/dobę

    do 100 zasad/próbkę

    czułość >99%

    koszt 10 000 $/analizę


    5500xl solid system

    5500xl SOLiD™ System

    w oparciu o ligację komplementarnych frag.

    jednoczesna analiza 12 różnych próbek

    300 mld zasad/analizę, 7 dni

    do 45 mld zasad/dobę

    do 75 zasad/próbkę

    czułość 99.99%

    koszt 6 000 $/analizę


    Post p w sekwencjonowaniu

    Postęp w sekwencjonowaniu


    Podsumowanie

    Podsumowanie

    • najlepsze efekty daje połączenie kilku metod

    • konieczne nowej jakości badania strukturalne i asocjacyjne :

      • RNA

      • białek

      • innych oddziaływań ze środowiskiem o nieznanym dotąd charakterze


  • Login