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Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes

Les Îlots de pathogénicités (PAI). Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes. Denis Dacheux-Deschamps. Les Îlots de pathogénicités (PAI). Le monde bactérien. 5000 espèces de bactéries décrites, 200 000 à 500 000 espèces bactériennes estimées,

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Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes

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Presentation Transcript

  1. Les Îlots de pathogénicités (PAI) Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes Denis Dacheux-Deschamps

  2. Les Îlots de pathogénicités (PAI)

  3. Le monde bactérien • 5000 espèces de bactéries décrites, • 200 000 à 500 000 espèces bactériennes estimées, • 200 sont pathogènes pour l’Homme. • séquençage exponentiel des génomes de Bactéries pathogènes ou non • Transferts de gènes via • la conjugaison, la transduction et la transformation. • Génome bactérien : « partie centrale (cœur) et partie flexible »

  4. Génome procaryote Hacker and Carniel 2001 EMBO rep.

  5. Genomic Islands > 10kb PAI Hacker and Carniel 2001 EMBO rep.

  6. Genomic Islands Hacker and Kaper 2000 Annu. Rev.Microbiol.

  7. Non-Pathogène int virA virB virC mobA ∆mobB Pathogène Îlots de Patogènicité (PAI) tRNA Hacker and Kaper 2000 Annu. Rev.Microbiol. int : gènes d’intégrase ; vir : gènes de virulence ; mob : gènes de mobilisation • E. coli puis nombreuses bactéries Gram + ou Gram – (pathogènes de plantes ou animaux) • 10 à 200 kb, % G+C différent, extra- ou intrachromosomique, PAI absent chez les bactéries non pathogènes de la même espèce

  8. Fonctions associés aux PAI Hacker and Carniel 2001 EMBO rep.

  9. Gènes de virulence associés aux PAI Adhésines ex : intimine adhérence intestinale pour EPEC/EHEC (attachement effacement) Système de sécrétion Principalement le SS de type III (TTSS) et le type IV • Invasines, modulines • Ex : Salmonella 5 PAI (SPI) SPI-1 invasion C. épithéliales • SPI-2 intracellulaire prolifération • SPI-3&-4 intramacrophage survie • SPI-5 inflammation et sécrétions intestinales Toxines Pore forming : hémolysine (UPEC), listériolysine O (Listéria sp) Protéase, lipase, enterotoxine, ADP ribosilation (prot G) Superantigène Système capture du fer Récepteur au fer : sidérophores (yersiniabactine…) Autres Résistance sérum, apoptose, IgA protéase, gènes inconnus

  10. Régulation des PAI • Gènes de régulation codés par le PIA ou extérieur : Activateur de transcription type AraC (TTSS ExsA ; VirF 37°C Yersinia) + Régulateur de réponse à deux composants (PhoP/PhoQ, Mg 2+, SPI-1) Facteur sigma Histones

  11. Sites intégrations des PAI DR DR • DR: direct repeat 9-135 pb • parfois similaire au site att des phages ou IS (élément d’insertion) • 75% des PAI insérés en 3’ des ARNt

  12. Intérêt des tRNA • Insertion ancestrale des phages ou plasmides • Plusieurs copies du gène ARNt • Gène ARNt non indispensable (ex selC ARNt) • selC ARNt(selenocystéine) le plus ciblés • Utilise souvent le promoteur

  13. Mobilité des PAI • Intégrase, recombinase généralement codées par le PAI • Souvent par transduction (lors d’infection) (supposé) • Intra-chromosomique (Yersinia), • Intra-espèce, • Inter-espèce (supposé) • perte mobilité (mutation, délétion) ….Évolution

  14. Évolution des PAI Hacker and Kaper 2000 Annu. Rev.Microbiol.

  15. Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes

  16. Phagocytose Antibiotiques Type III Type IV Type II Exopolysaccharide Elastase Type I Adhésion cellulaire Phospholipase Pili Exotoxine ... Protéase alcaline ... Flagelle Type V Auto- tranporteur CagA... Plasmide Ti Systèmes de sécrétions protéiques Les facteurs de virulence bactérienne Survie et multiplication dans l’hôte

  17. Les différents systèmes de sécrétion des bactéries Gram-négatives • Nombreuses protéines bactériennes sécrétées, d’activités diverses dont des facteurs de virulence. • Type I à V (I et III sec indépendant) Exportation, sécrétion, translocation

  18. Le système de sécrétion de type III (TTSS) Injection dans le cytoplasme de la cellules Eucaryotes (Translocation) de protéines bactériennes toxiques. Contact physique Cellules - Bactéries Toxines injectées homologues à des protéines Eucaryotes agissant sur les voies de signalisation.

  19. La sécrétion de type III chez les bactériesGram-négatives Identifiée chez de plus en plus de bactéries pathogènes Phyto-Pathogènes : Pseudomonas syringae, Erwinia spp., Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Rihzobium spp. Pathogènes d’animaux : Intracellulaire Extracellulaire

  20. ExoU Burkholderia Bortedella BopC ExoY Mort cellulaire ExoS ExoT Caspases P. aeruginosa YopM IpaB Cytosquelette d’actine IpaA Shigella NF-kB Inflammation YopT SipB SipA MAP Kinase SipC YopE SopE YopH YopP/J Yersinia SopB Salmonella EspB Tir EPEC La sécrétion de type III chez les pathogènes animaux Intracellulaire Extracellulaire

  21. Isolation du système de sécrétion de type III Structure du complexe inséré dans la paroi bactérienne Complexe isolé (Sukhan et al., 2001, J. Bac) (Kubori et al., 1998, Science)

  22. schema Purification du complexe (« seringue + aiguille = Injectiosome ») Salmonella typhimurium Yersinia enterocolitica (Kimbrough et Miller 2000, PNAS) Shigella flexneri (Cornelis 2002, Nature) (Blocker et al., 2001, Mol. Mic)

  23. Diversité des systèmes de sécrétion de type III bactériens (Cornelis 2002, Nature)

  24. Structure de l’appareil de sécrétion de type III « Injectiosome » 12 nm Appareil de translocation « Translocateur » 2 à 4 nm 50 nm Appareil de sécrétion Membranes bactérienne 30 nm Cytoplasme bactérien Effecteurs toxiques type III

  25. Organisation génétique des gènes codant l’appareil du TTSS • Gènes regroupés en « cluster » ou « îlot de pathogénicité » (PAI). • Souches non pathogènes ne possèdent pas ces PAI. • Cluster de gènes présent soit sur le chromosome bactérien • ex: S. typhymurium, P. aeruginosa, EPEC • soit sur un plasmide • ex: S. flexneri • soitsur les deux • ex: Yersinia spp. • Gènes organiséssous la forme d’opérons. • Gènes de structure du TTSS très conservés entre différents pathogènes.

  26. Gènes codant l’appareil du TTSS (15 à 20 gènes) Animaux Végétaux Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev.

  27. Modèle d’assemblage du complexe TTSS Galan, 2001 Annu. Rev.Cell. Dev. Biol. Marlovits, 2006 Nature

  28. Caractérisation structurale de la base du TSS EscJ(EPEC) (Calvin et al 2005, Nature)

  29. Gènes codant les effecteurs bactériens injectés • Gènes localisés à l'extérieur des clusters: - sur plasmide de virulence associés aux gènes du TTSS. - ou dispersés sur le chromosome • Co-régulation transcriptionnelle avec les gènes de l’appareil du TTSS. • Protéines variant en taille, structure et fonction et espèces-spécifiques. • Certains domaines des effecteurs sont homologues entre différentes bactéries. • Effecteurs possédant des activités eucaryotes. (origine eucaryote)

  30. Fonctionnement du TTSS 1. Appareil de sécrétion exprimé à la surface de la bactérie enposition fermée par protéines. 2. Contact avec membrane cellule eucaryote, ouverture du canal, (position ouverte). 3. Sécrétion protéines du translocateur, par la canal s’insérant dans la membrane eucaryote (pore). Communication entre cytoplasmes bactérien et eucaryote. 4. Translocation des effecteurs protéiques dans la cellule cible.

  31. Modèle générale du TTSS Blocker et al., 2000 Mol. Micro.

  32. Exemple de Modèle du TTSS chez Yersinia spp. (Cornelis 2002, J.C.B.)

  33. Régulation transcriptionnelle des gènes du TTSS • Activateur transcriptionnel commun de type AraC, actif sur tous les opérons et gènes du TTSS (effecteur et structure). • Régulateurs de réponse à deux composants espèce-spécifique. Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev.

  34. ExsA Exemple de régulation transcriptionnelle Yersinia spp. S. flexneri - P.aeruginosa + + psc pop exsD exs C B A + exo

  35. Signaux d’activation transcriptionnelle in vitro • Température : induction à 37°C (Yersinia, Shigella) • Osmolarité (Shigella, Pseudomonas, Salmonella) • pH : répression si inférieur à 7-8 (Shigella) • activation si acide (Salmonella) • Phosphate : (Salmonella) • Oxygène : (Salmonella) • Calcium/ Magnésium : répression (Yersinia, Pseudomonas, Salmonella )

  36. Signaux d’activation transcriptionnelle ex vivo / in vivo Contact cellule-bactérie Pettersson et al, 1997 Science Y. pseudotuberculosis / HeLa

  37. 100 • Modèle des chaperonnes • -15ème au 100ème AA Nter reconnu par une protéine chaperonne. (ex YopE et SycE). Signal de sécrétion des effecteurs via le complexe TTSS Nter Cter 1 15 AA • Modèle ARNm • -15er AA Nter suffisant pour certaines protéines (ex: YopN) • -pas séquence signal identifiée mais structure sur ARNm incluant AUG.

  38. Ribosome Chaperonne Syc ARNm yop Protéine de fermeture Répresseur traductionnel yop Récepteur chaperonne Récepteur ribosome Polypeptide yop Les deux modèles de sécrétion Andersonet al, 1999 Trends Micro.

  39. Les protéines chaperonnes Cter Nter 14 kDa pHi acide (4,4 à 5,2) hélice  amphiphile Fixation Protéine effectrice • séquence putative AA reconnue. • à proximité du gènes de l’effecteur à fixer. • maintiennent conformation (non active) de l’effecteur, indispensable à la sécrétion. • Non présentes pour tous les effecteurs à transloquer.

  40. Cellule cible Bactérie Activation de la sécrétion de type III Contact La translocation Signal in vivo : contact Cellules / Bactérie

  41. effecteurs inductibles (répression avant contact) Translocation directionnelle Pseudomonas et Yersinia

  42. effecteurs accumulés avant contact Translocation non directionnelle Salmonella (SP-1) et Shigella

  43. = non invasive = SPI-1 TTSS- Schlumberger et al, 2005 PNAS.

  44. Start 10-90sec End pool 100-600 sec (6-/+3.103molecules) Schlumberger et al, 2005 PNAS.

  45. Contact = récepteurs in vivo ? Récepteurs bactériens et ligands cellulaires ? Cellule cible Bactérie Activation de la sécrétion de type III Récepteurs Récepteurs bactériens TTSS identifiés ex : Yersinia YopN Salmonella SipD Shigella IpaD Ligands cellulaires ex: Intégrine 51 ( IpaA, IpaC, IpaD)

  46. « Le translocateur » Bactéries Cellules m B mp C. contact transclocateur Effecteurs

  47. « Le translocateur » YopB Yersinia YopD Shigella IpaB • Domaines hydrophobes ( ) • formant spontanément des pores membranaires (hémolyse) • Chaperonnes car lytiques pour bactéries (YopB / SycD) • Bi-fonctionnelle effecteur/translocateur (IpaB, SipB)

  48. ExoT ExoT ExoS ExoS PopB PopB ExoT PopD PopD ExoS PopB PopD Les effecteurs de type III, sécrétion in vitro CHA- ExsA CHA- ExsA CHA- ExsA CHA- ExsA CHA- ExsA P. a ExsA ExsAC ExsAC P. a CHA ExsAC ExsAC ExsAC Pseudomonas aeruginosa EGTA/MgCl2 EGTA/MgCl2 EGTA/MgCl2 - - + + - - + + - + - + - + - - + + - - + + - - + + - - + + kDa kDa kDa 98 98 98 64 64 64 Effecteurs 50 50 50 Translocateur 36 36 36 30 30 30 Dacheux et al, 1999 Infect. Immun. Induction sécrétion in vitro (mime le contact) : - Déplétion en Calcium (Pseudomonas, Yersinia (+37°C)) - Colorant Rouge Congo (Shigella, Salmonella)

  49. 100 80 P.a Hémolyse (540 nm, %) 60 40 20 P.a pcrV 4000 3000 6000 2000 1500 1000 RPMI sucrose raffinose PEG Détermination de la taille du pore Osmoprotection Diamètre de 1,3 à 3 nm Dacheux et al, 2001 Mol. Mic.

  50. Modèle PopB/PopD (P. aeruginosa) Schoehn et al, 2003 EMBO

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