Enkele (“veel”)-gebruikte waardcel-stammen
Download
1 / 16

Enkele (“veel”)-gebruikte waardcel-stammen HB101 (Herbert Boyer) - PowerPoint PPT Presentation


  • 155 Views
  • Uploaded on

Enkele (“veel”)-gebruikte waardcel-stammen HB101 (Herbert Boyer) supE44 hsdS20 (r B - m B - ) recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 Een hybride stam ontstaan door een kruising tussen een E. coli K12 x E.coli B

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Enkele (“veel”)-gebruikte waardcel-stammen HB101 (Herbert Boyer)' - claus


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

Enkele (“veel”)-gebruikte waardcel-stammen

HB101 (Herbert Boyer)

supE44hsdS20(rB- mB-) recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1

Een hybride stam ontstaan door een kruising tussen een E. coli K12 x E.coli B

kruising. Een amber-suppressor. Oorspronkelijk gebruikt voor grootschalige

plasmideproductie en “efficiente” transformatie.

RR1 : is een recA+ derivaat van HB101

c1778 dap (deficient in synthese van diaminopimelinezuur, essentieel voor peptidoglycaanopbouw)

DH1 (Doug Hanahan)

DH5

DH5a

DH10

DH10B

JM101 (Joachim Messing)

supE thi D(lac-proAB) F’ (traD36 proAB+ lacIq lacZDM15)

(JM103)

TG1 (Toby Gibson) Een EcoK- derivaat van JM101 (noch restrictie, noch modificatie)

TG2 Een recombinatie-deficient derivaat van TG1.


Strain Information

E. coli K-12 MG1655

Description

Genotype: F- lambda-ilvGrfb-50 rph-1

Serotype: OR:H48:K-

This strain was sequenced by the Blattner laboratory because it approximates wild-type

E. coli and "has been maintained as a laboratory strain with minimal genetic manipulation,

having only been cured of the temperate bacteriophage lambda and F plasmid by means

of ultraviolet light and acridine orange, respectively." (Blattner, et al. 1997).

The mutations listed in the genotype are present in most K-12 strains and were probably

acquired early in the history of the laboratory strain.

- A frameshift at the end of rph results in decreased pyrE expression and a mild

pyrimidine starvation, such that the strain grows 10 to 15% more slowly in

pyrimidine-free medium than in medium containing uracil.

- The ilvG mutation is a frameshift that knocks out acetohydroxy acid synthase II.

- The rfb-50 mutation is an IS5 insertion that results in the absence of O-antigen

synthesis.

MG1655 was derived and named by Mark Guyer from strain W1485, which was derived

in Joshua Lederberg's lab from a stab-culture descendant of the original K-12 isolate.

This original E. coli strain K-12 was obtained from a stool sample of a diphtheria patient

in Palo Alto, CA in 1922.


MG1655 1997, volledige genoomsequentie van E.coli K12 (Blattner et al.)

MC1061 startpunt van Doug Hanahan voor de constructie van DH1 en verder tot DH10B

belangrijke elementen in deze stappen :

recA1 : verbeteren van de kloonstabiliteit (homologe recombinatie verhinderen)

endA1 : inactiveert de codering van het periplasmatisch DNA-specifieke

endonuclease => verhoogt de DNA stabiliteit tijdens transformatie

een defectief f80 faag met lacZDM15 voor screening door a-complementatie

een deoR mutatie zou aanwezig zijn die verhoogde transformatie-efficiëntie geeft,

maar dit blijkt nu op een foute interpretatie te berusten.

(er blijken nu 52 kandidaat-gemuteerde-genen te zijn potentieel verantwoordelijk voor dit interessante fenotype)

DH10

DH10B : na Tn10 insertie (in mdoB) werd met 2-carboxyl, 5-butyl pyridine (5-butyl picoline of ‘fusaric acid’ : heeft antivirale eigenschappen) de TcR(van het Tn10) tegengeselecteerd (i.a.v. een plasmide dat recA tot expressie bracht,

en nadien verwijderd werd).

Met het verwijderen van de Tn10 merker werd in het isolaat DH10B het flankerende DNA

met de MDRS loci gedeleteerd (mrr, mcrA, mcrB, mcrC). Dit verhoogt de efficientie van

klonering van zoogdier DNA, waarin cytosine vaak gemethyleerd is.

D10B tonA : spontane mutant die werd geselecteerd. tonA geeft resistentie tegen de

fagen T1, T5 en f80. Is commercieel verkrijgbaar (Invitrogen NV)


DeoR : proteine met Mr = 30.500

repressor van deo operon (betrokken bij het nucleoside catabolisme)


De co-lineariteit tussen MG1655 en DH10B is behoorlijk, maar wat vooral

opvalt is de veel hogere mutatiesnelheid in DH10B.

De mutatiesnelheid van DH10B is 13,5 maal hoger t.o.v. MG1655.

Dit blijkt echter niet te wijten aan puntmutaties, noch aan deleties,

maar aan IS-elementen, voornamelijk IS150.

Er zijn 226 gemuteerde genen in DH10B tegenover MG1655, vooral als

gevolg van de genetische manipulaties (transducties).

Er is enige “remodelling” van de genoomarchitectuur, o.a. een 113.260 bp

tandem herhaling.

DH10B is een Leu-auxotroof (deletie van leuLABCD) : groeit op

minimaal medium alleen i.a.v. leucine. De groeisnelheid is lichtjes trager

dan van de wild-type stam.


Meestal transductie met faag P1 vanuit wat vooralE.coli K12 stammen,

behalve met D7091F die een E.coli B stam is.


De basesamenstelling doorheen het genoom is niet random. wat vooral

De "G-C skew" (d.i. de verhouding G-C/G+C) is uitgezet als een 10-kb

venstergemiddelde voor een van de strengen van het ganse genoom.

De skews zijn uitgesplitst voor de 3 codonposities (lijn 1, 2 en 3), voor

alle posities samen (lijn 4), voor de linksgerichte genen (lijn 5), de

rechtsgerichte genen (lijn 7) en de niet-eiwitcoderende gebieden (lijn 6).

De twee verticale lijnen geven de positie van ori aan(in de buurt van bp

3.900.000)en van replicatieterminatie(in de buurt van bp 1.600.000).


ad