Dna replication of dna
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第三章 DNA 复制 (Replication of DNA) PowerPoint PPT Presentation


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第三章 DNA 复制 (Replication of DNA). DNA 复制一般特征 参与 DNA 复制的酶类 DNA 复制基本过程 DNA 复制的调控 DNA 损伤与修复. 第一节 DNA 复制的一般特征. 一、 DNA 的生物学功能 1 、储存遗传信息 2 、复制遗传信息 3 、表达遗传信息 4 、遗传变异. 1962, Nobel Prize. Watson(Nature,1953) : 我们假设的特异的(碱基)配对方式提示了遗传物质可能的复制机制:每一条链均可作为合成一条新链的模板,就使子代双螺旋与母本完全一致。. 全保留. 半保留.

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第三章 DNA 复制 (Replication of DNA)

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Presentation Transcript


Dna replication of dna

第三章DNA 复制

(Replication of DNA)


Dna replication of dna

  • DNA 复制一般特征

  • 参与DNA复制的酶类

  • DNA复制基本过程

  • DNA复制的调控

  • DNA损伤与修复


Dna replication of dna

第一节 DNA复制的一般特征

一、DNA的生物学功能

1、储存遗传信息

2、复制遗传信息

3、表达遗传信息

4、遗传变异

1962, Nobel Prize


Watson nature 1953

Watson(Nature,1953) :我们假设的特异的(碱基)配对方式提示了遗传物质可能的复制机制:每一条链均可作为合成一条新链的模板,就使子代双螺旋与母本完全一致。


Dna replication of dna

全保留

半保留

分散式

二、DNA复制方式

DNA如何进行复制?


Dna replication of dna

15N

P0

P1

P2

P3

P4

P0+P2

P0+P4

14N 15N/14N 15N

Meselson-Stahl experiment

1958, PNAS


Dna replication of dna

根据实验结果:第一代DNA仅有一条带否定了全保留复制的可能

第二代出现两条带,一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能,证明DNA只能是半保留方式进行复制

DNA的半保留复制Semiconservative Replication

DNA双链解开,以单链做模板,碱基互补原则,各自合成一条链。在新合成的DNA双链分子中,一条是原来的老链,一条是新链。


Dna replication of dna

2 DNA复制的半不连续性

复制时DNA链延伸可能有三种方式:

没有从3’ 5’ 延长DNA链的聚合酶

1

2

3

1967年,日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生100~1000bp的短片段


2 dna

2 DNA复制的半不连续性

  • 一条链连续合成,称主导链,Leading Strand 另一条链分段合成,称随从链Lagging Strand。

  • 原因:DNA双螺旋分子两条链方向相反,新链合成的方向只能5’→3’一个方向合成。


3 dna

3 DNA复制的双向性

在两个方向同时进行,形成两个复制叉(Replication Fork ).


Dna replication of dna

概括:

  • 半保留

  • 半不连续性

  • 双向性


Dna replication of dna

第三节 参与DNA复制的酶类

参与DNA复制的酶或蛋白因子:

1 DNA聚合酶 催化DNA的合成

2 引物酶 起始RNA的合成

3 连接酶 连接冈崎片段

4 DNA解链,解旋酶

5 DNA结合蛋白


Dna polymerase

一 DNA聚合酶(Polymerase)

1956年,大肠杆菌DNA聚合酶

1959,Nobel Prize

(一) 作用机制

以DNA做模板,碱基互补配对,催化4种dNTP之间形成磷酸二酯键,从而延长DNA链。


Dna replication of dna

Mg2+


Dna replication of dna

  • 在模板链上进行

  • 不能从头合成,在引物的3’OH端上延长

  • 新链延长方向为5’→3’延长


Dna replication of dna

(二)原核生物DNA聚合酶

  • 有3种:DNA聚合酶 I,II,III。

  • 多功能酶:

  • 合成DNA的活性 聚合酶作用,延长DNA链。

  • 水解DNA的活性 外切核酸酶活性,切除不配对碱基,起校读作用


1 dna i

1、DNA聚合酶 I

大肠杆菌DNA聚合酶I :

单链多肽蛋白质,分子量为109KD.

性质:多功能酶

大亚基:5’→3’聚合酶活性

3’→5’外切酶活性

小亚基:5’→3’外切酶活性。

1000nt/min


Dna replication of dna

3’→5’外切酶活性

􀁺 从游离3’-OH端切割,识别和消除不配对的核苷酸,保证了DNA复制的忠实性。

5’-3’外切酶活性

DNA聚合酶I中的小亚基带有5’外切酶活性,从双链DNA的5’端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸。


Dna replication of dna

3’→5’外切活性示意图


Dna replication of dna

DNA聚合酶特有活性


Dna i dna

DNA聚合酶I 在DNA复制中所起的作用

  • 不是主要的复制酶

  • RNA引物的切除

  • DNA损伤的修复:紫外线作用形成的TT二

    聚体的切除

  • 链置换: 可能参与遗传重组

  • 切口平移(nick translation)

    探针标记


2 dna ii

2 DNA聚合酶II

  • 不是复制酶,主要在DNA修复中起作用,无5’→3’外切酶活性。

    5% DNA聚合酶I的活性


3 dna iii

3 DNA聚合酶 III

1972年发现

催化效率高,主要复制酶。由10种亚基组成:

      ’   

(1)核心聚合酶:  :5’-3’DNA聚合酶活性

 :3’-5’外切酶活性,控制

复制忠实性

:核心酶的组建


Dna replication of dna

(2) 二聚体: 构成滑动钳,将全酶固定在DNA模板上,提高合成速率(20/秒----750/秒。

(3) 复合物 :2’ 协助  二聚体结合到 DNA


Dna replication of dna

'

'

ε

ε

E. coli DNA聚合酶Ⅲ不对称二聚体


Dna iii

DNA聚合酶 III

  • 形成不对称的二聚体,与DNA双链结合,后随链折叠1800,使后随链的物理方向与主导链一致,同时催化两条链的复制。


Dna replication of dna

3

5

解链方向

3

5

领头链

(leading strand)

后随链

(lagging strand)


Dna replication of dna

大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较

DNA 聚合酶 polⅠ polⅡ pol Ⅲ

亚基数目 1 ≥7 ≥10

5 ′→3 ′聚合酶活性 + + +

3 ′→5 ′外切酶活性 + + +

5 ′→3 ′外切酶活性 + --

聚合速度(核苷酸/分) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ≥500 000

功能 切除引物,修复 修复 复制


Dna replication of dna

(三) 真核生物DNA聚合酶


Dna replication of dna

DNA聚合酶的作用

  • DNA聚合酶 : 多亚基、多功能酶。

  • 大亚基:DNA聚合酶活性。 100nt/次

  • 小亚基:引物酶活性,合成RNA。

  • 起始DNA的合成:合成RNA引物和在RNA3’羟基端合成一段DNA。


Dna replication of dna

DNA聚合酶的作用

  • DNA聚合酶的结构

  • 多亚基组成:

  • P125 大亚基,催化亚基,含聚合酶和 外切酶活性

  • P50 与增殖细胞核抗原(PCNA)结合相关

  • P66

  • P12


Dna replication of dna

DNA聚合酶的功能

  • 主要DNA复制酶:DNA聚合酶活性,延伸DNA链。

    与RFC和PCNA形成“全酶”,在RFC和PCNA等的协同下,促使DNA聚合酶的解离, DNA聚合酶接替DNA聚合酶继续DNA链的合成------- DNA聚合酶向DNA聚合酶的转换。

  • 复制校正功能:3’-5’外切核酸酶活性


Dna replication of dna

  • DNA聚合酶 、 主要功能:DNA修复。

  • DNA聚合酶γ:线粒体DNA复制


Dna replication of dna

二、真核生物DNA聚合酶附属蛋白

1、PCNA:增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen), DNA聚合酶的附属蛋白,参与DNA的合成,类似二聚体。

2、RFC:复制因子C(Replication Factor C)。多亚基复合物,DNA聚合酶的附属蛋白,识别引物末端,参与链的延长。类似复合物。


Dna replication of dna

3、PRP1和PRP2

Primer Recognition Protein

增加DNA聚合酶与模板-引物末端的亲和力,增加DNA聚合酶的活性。


Pcr taq dna

PCR 与Taq DNA 聚合酶

Taq DNA聚合酶特性(Taq DNA polymerase)

最初由H.A.ErlicH从热泉中的细菌中出来

􀂙 性质

具有5’-3’聚合酶活性以及依赖于聚合作用的

外切酶活性

􀂙 耐热性

此酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶

最适反应温度为72℃-80℃

􀂙 应用

能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA

为模板,进行DNA的体外扩增-PCR反应。


Primase

三 引物酶 primase

DNA聚合酶不能引发DNA新生链的合成,只能在已存在的DNA链或RNA链上延长DNA。引物酶催化引物RNA的合成。


Ligase

四 连接酶 ligase

  • 1967年发现

  • 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成,二个片段必须都与完整的模板链结合。

  • 大肠杆菌的连接酶需NAD+,真核细胞的连接酶需要ATP。

  • 可连接双链DNA中的单链切口,RNA-DNA杂交体双链单链切口,不能连接双链RNA中的单链切口。


Dna replication of dna

五 与DNA解链和解旋有关的酶


Dna replication of dna

五 与DNA解链和解旋有关的酶

(一)DNA螺旋酶(Helicase)

  • 催化双螺旋解旋和解链

  • 需消耗ATP


Dna replication of dna

(二)拓扑异构酶(Topoisomerase)

  • DNA 回旋酶(Gyrase)

  • 促进DNA双链的解开,需消耗ATP。

  • 兼有内切酶和连接酶活性, 可迅速使DNA两条链断开又接上, 消除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量, 同复制有关。


Dna replication of dna

(三)单链结合蛋白

  • DNA单链结合蛋白(Single Strand Binding protein,SSB)

  • 复制因子A

  • 主要功能: 与单链亲和力大,稳定单链结构,保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成,有利复制进行。


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第二节 DNA 复制的基本过程


Replicon

复制子 Replicon

  • Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子, 或者说单个复制起始点控制的DNA,包含从起始位点到终止位点的全部DNA。

  • 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点。

  • 终止位点 终止复制的位点

  • 每个细胞周期启动复制一次。


Dna replication of dna

复制在特定部位起始。

原核生物仅有一个起始部位。

真核生物有多个起始部位。


Dna replication of dna

复制起始点、复制子与复制叉


250mb 1 250

半保留复制,必须解决解开双螺旋的问题。250Mb的1号染色体,需要旋转250万次。

DNA拓扑异构酶解决了解开DNA双螺旋的问题


Dna replication of dna

DNA复制过程:

一 复制的起始

(一)起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点:origin, ori


Dna replication of dna

1、 M13噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构


Dna replication of dna

2、大肠杆菌(OriC)的起始部位顺序特征

240bp的唯一起始部位

2个区域:

起始蛋白识别结合区:4个9bp重复顺序

邻近的AT富含区3个13bp重复顺序。


Dna replication of dna

大肠杆菌基因组复制起始部位


Dna replication of dna

3、酿酒酵母起始部位顺序特征

100-200bp

A: 含ARS一致序列(ACS),复制起始识别复合物结合

B:增加复制起始位点的效率


4 sv40 simian vacuolating virus 40

4、 SV40起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40猴空泡病毒

  • 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

  • CACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

  • GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

  • 反转重复序列 大T抗原结合部位 II A/T 富含区

    图3-7 SV40 复制起始部位结构


Dna replication of dna

复制起始位点特征:

  • 独特重复序列

  • 起始结合蛋白识别

  • AT富含序列,有利于DNA双链解旋


Dna replication of dna

5、起始部位的顺序特征(高等真核生物)

  • 多个复制起始点,有人发现任何大于15kb的DNA就能自主复制。

  • 起始不是随机的,但未发现起始位点的特征序列。

    特征:结合复制相关蛋白

    一个细胞周期复制一次

    不同细胞复制起始位点的应用存在差异


Dna replication of dna

(二) 起始需要多种蛋白因子参与

1噬菌体(X174)

  • priA 识别起始位点,ATP酶活性

  • priB 起始引发

  • priC 起始引发

  • DnaT 起始引发

  • DnaB 起始引发

  • DnaC 起始引发,与DnaB一起作用

  • DnaG RNA引物合成


Dna replication of dna

2 大肠杆菌

  • DnaA 识别并结合于oriC区,有ATP酶活性,使AT富含区解链,促进DnaB结合形成起始复合物。

  • DnaB DNA螺旋酶,有解旋和解链作用。

  • DnaC 运输DnaB,形成起始复合物。

  • DnaG DNA复制引发酶,合成引物。

  • Hu 促进复制复合物的形成。

  • 回旋酶 松弛正超螺旋,促进单链DNA产生。

  • 单链结合蛋白 促进DNA解链,稳定单链DNA。


3 sv40

3、真核细胞(SV40)

  • 真核细胞(SV40)的DNA复制至少需要6个蛋白因子参与。

  • T抗原:N端为DNA结合区,识别起始位点,C端具有螺旋

    酶活性,在RFA的协助下解开双链。

    SV40 编码

  • RFA:人单链结合蛋白

  • 拓补异构酶I或II:解开超螺旋。

  • 复制因子C(replication facter C, RFC):形成起始复合物

  • DNA聚合酶α-引物酶复合物:合成引物,起始DNA合成。


4 yeast

4、真核细胞(Yeast)

(1) ORC( Origin Recognition Complex)

6个亚基组成 在真核生物中相当保守

特异识别ARS (Autonomously replicating sequence)

ORC1p,ORC2p,ORC4p 与A 元件结合,

ORC5p与B元件结合

结合过程需要ATP


Dna replication of dna

(2) Cdc6/Cdc18

(3)微染色体支持蛋白(Minichromosome maintenance proteins,MCMp)

与DNA发生周期性的作用,与复制叉运动有关。

(4) Cdc45

与DNA复制起始位点相互作用。


Dna replication of dna

(三)复制的起始--引发(Priming)

合成RNA引物的过程


Dna replication of dna

1、M13噬菌体

单链结合蛋白SSB与M13噬菌体单链DNA结合,在发夹结构前6 bp处,RNA聚合酶合成 20~30个碱基的RNA. 破坏发夹结构;SSB结合;DNA聚合酶III在3’-OH延长DNA链。 DNA聚合酶I水解RNA,并补平缺口,连接酶连接。


Dna replication of dna

在DnaT帮助下DnaB,DnaC复合物结合形成前引发体

2、ФX174DNA

  • priA,priB,priC识别起始点

PAS:primosome assembly site

引发体

  • 引发体的装配只能在起始点,引物合成可在多处。

  • 引发体移动的方向与DNA链延长的方向相反。

  • 类似冈崎片段的合成

引发体可沿着DNA链移动,在合适的位点起始引物RNA的合成


Dna replication of dna

3、大肠杆菌

Hu因子促进复合物形成


Dna replication of dna

2DnaB-DnaC复合物

DnaA结合OriC

富含AT区解链

DnaB解链


4 sv40

4 SV40

T抗原识别起始点和解链

拓扑异构酶参与下形成前引发体

RFA结合到单链DNA

DNApol -引物酶结合形成引发体

SV40 DNA复制的起始


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