Metody wytwarzania biofarmaceutyków
Download
1 / 38

Metody wytwarzania biofarmaceutyków Wytwarzanie białek terapeutycznych - PowerPoint PPT Presentation


  • 186 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Metody wytwarzania biofarmaceutyków Wytwarzanie białek terapeutycznych. Etapy opracowania procesu technologicznego dla wytwarzania białek terapeutycznych. Konstrukcja metodami inżynierii genetycznej Izolacja genu, ewentualna modyfikacja Dobór wektora klonowania

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha

Download Presentation

Metody wytwarzania biofarmaceutyków Wytwarzanie białek terapeutycznych

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Metody wytwarzania biofarmaceutyków

Wytwarzanie białek terapeutycznych


Etapy opracowania procesu technologicznego

dla wytwarzania białek terapeutycznych

  • Konstrukcja metodami inżynierii genetycznej

  • Izolacja genu, ewentualna modyfikacja

  • Dobór wektora klonowania

  • Konstrukcja wektora ekspresji

  • Dobór układu gospodarz-wektor

  • Biotechnologiczne opracowanie procesu technologicznego

  • Fermentacja

  • kolby wstrząsane

  • fermentor laboratoryjny

  • fermentor w skali pilotażowej

  • optymalizacja podłoża i prowadzenia procesu produkcyjnego

  • Obróbka

  • zbiór komórek

  • oczyszczanie wstępne

  • oczyszczanie dokładne

  • Opracowanie produktu

  • Opracowanie postaci leku

  • Testy farmakologiczne

  • Testy kliniczne

  • Dopuszczenie do obrotu


Warunki wytwarzania białek rekombinowanych

  • Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid

  • kodujący białko w wektorze z markerem oporności na antybiotyk

  • i obszar induktorowy.

  • Fermentacja okresowa z zasilaniem. Wzrost początkowy w pożywce minimalnej (glukoza + ekstrakt

  • drożdżowy + sole + antybiotyk).W fazie początkowej wzrostu dodawanie składników odżywczych

  • w kontrolowany sposób. Źródło azotu – sole amonowe, mocznik. Po osiągnięciu fazy intensywnego

  • wzrostu – dodanie induktora. Proces trwający 24 – 48 h w temperaturze 24 – 28 C.

  • Osiąga się do 50% ogólnej puli białek, z wydajnością 10 – 15 g/L

  • 2. Producent grzybowy – drożdże (S. cerevisiae, Pichia pastoris),

  • grzyby pleśniowe– Aspergillus, Fusarium. Gen zintegrowany

  • z chromosomalnym DNA + efektywny promotor.

  • Fermentacja 4 – 8 dni. Pożywki z tanimi źródłami węgla i azotu.

  • Białka często wydzielane poza komórkę, co obniża koszty izolacji.

  • Producent - komórki owadzie lub ssacze w hodowli tkankowej in vitro .

  • Komórki ludzkie – gen zmodyfikowany w obszarze promotora. CHO –

  • Chinese hamster ovary (komórki jajnika chomika chińskiego). BHK –

  • Baby hamster kidney (komórki nerki chomika). Komórki owadzie,

  • gen włączony w genom baculowirusa Autographa californica

  • Standard w przypadku wytwarzania przeciwciał (komórki hybrydowe).

  • 4. Transgeniczne rośliny lub zwierzęta


Wybór systemu ekspresyjnego

Białka, które są glikoproteinami nie mogą być wytwarzane

w komórkach bakteryjnych. Komórki grzybów wytwarzają

glikoproteiny o innej budowie niż komórki ssacze.


Produkcja białek terapeutycznych

Wymagania stawiane produkcji białek terapeutycznych – UE

  • Produkcja

  • Produkcja polega na zwalidowanym systemie posiewowym (seed lot system), w którym

  • używa się sprawdzonego, odpowiedniego układu gospodarz-wektor, dopuszczonego

  • do stosowania przez odpowiednie władze. System posiewowy obejmuje kultury mateczne

  • oraz kultury robocze, wyprowadzone z kultur matecznych. Konieczne jest wykonanie

  • szczegółowego opisu etapów hodowli, ekstrakcji oraz oczyszczania

  • Wykazanie zdatności układu gospodarz-wektor i walidacja systemu posiewowego muszą obejmować

  • następujące etapy:

  • Klonowanie i ekspresja

  • charakterystyka fenotypowa i genotypowa komórki gospodarza, jej pochodzenia oraz składu podłoży

  • hodowli komórkowej.

  • dokumentacja strategii klonowania dla genu i charakterystyka rekombinowanego wektora,

  • w tym analiza sekwencji DNA genu i flankujacych regionów kontrolnych

  • Charakterystyka układu gospodarz – wektor

  • mechanizm przenoszenia konstrukcji podlegającej ekspresji do komórek gospodarza

  • liczbę kopii, stan fizyczny i stabilność konstrukcji podlegającej ekspresji wewnątrz komórki gospodarza

  • środki indukcji i kontroli ekspresji

  • Walidacja kultur produkcyjnych

  • wykazanie stabilności przez pomiar przeżywalności

  • wykazanie identyczności komórek za pomocą właściwości fenotypowych

  • wykazanie, że kultury są wolne od kancerogennych lub zakaźnych czynników chorobotwórczych


Produkcja białek terapeutycznych

Wymagania stawiane białkom terapeutycznym jako produktom finalnym – UE

Konieczne wykonanie testów chemicznych, fizycznych, biologicznych

i immunologicznych dotyczących identyczności, czystości, aktywności

i stabilności. Dla białek ludzkich wymóg absolutny – wykazanie

biozgodności – czyli identyczności produktu pod względem cech

biologicznych z białkiem naturalnym.

Przed uzyskaniem decyzji zwalniającej producent musi każdą serię

produktu sprawdzić pod względem identyczności i czystości.

W szczególności konieczne wykonanie analizy składu aminokwasowego

oraz częściowej analizy sekwencji aminokwasowej i sposobu połączenia

łańcuchów polipeptydowych (mostki disiarczkowe).


Wytwarzanie i izolacja białka terapeutycznego

Schemat ideowy produkcji rekombinowanej stafylokinazy


Wykorzystanie S-transferazy glutationowej (GST) jako narzędzia w oczyszczaniu

rekombinowanych białek.

Białko docelowe jest syntezowane jako białko fuzyjne z GST. Komórki producenta

poddawane są lizie i białko fuzyjne zostaje związane na kolumnie z wypełnieniem

Glutathione-Sepharose. Po przemyciu złoża, białko docelowe oddziela się od złoża

w wyniku działania proteazy rozszczepiającej białko fuzyjne.


Naturacja białek z ciał inkluzyjnych

Problem tworzenia

agregatów podczas

fałdowania białek

Mogą się tworzyć

w bakteryjnych

systemach ekspresji

1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie w

roztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie

potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa


Mikroinjekcja DNA do zapłodnionego jaja myszy


Transgeniczne krowy jako producenci białek

terapeutycznych

Krowa może dostarczać rocznie 5 – 10 tys. litrów mleka. Litr mleka może

zawierać około 50 g białka będącego produktem transgenu.

Projekt argentyński – cztery transgeniczne krowy zawierające gen kodujący

ludzką insulinę.

Uważa się, że w przypadku powodzenia projektu, 25 krów transgenicznych

wystarczy dla zaspokojenia potrzeb wszystkich diabetyków w Argentynie

(1,5 mln osób).

Pozyskiwanie preparatu zawierającego białko terapeutyczne?


Białko jaj

  • Doskonałe źródło rekombinowanych białek

  • Kura znosi rocznie ok. 300 jaj, a każde jajo zawiera ok. 6,5 g białka

  • Silny promotor genu owoalbuminy, zdolny wydajnie kierować ekspresją transgenu

  • w jajowodach transgenicznych kur, zapewnia możliwość produkcji ok. 2 g białka/jajo

  • Obecnie drugie po mleku potencjalne źródło biofarmaceutyków z wydzielin zwierząt transgenicznych

  • Trwają prace nad erytropoetyną, G-CFS

  • i przeciwciałami z jaj


Białka terapeutyczne - przykłady

Białka stymulujące powstawanie komórek krwi

Hematopoeza

Proces powstawania i różnicowania się komórek krwi (krwinek) obejmujący zachodzące w szpiku kostnym

dorosłych ssaków procesy powstawania krwinek czerwonych i białych oraz wytwarzanie limfocytów

w obrębie układu limfatycznego

Hematopoetyczne

czynniki wzrostowe

Białka stymulujące

końcowe etapy

różnicowania

komórek macierzystych

Szpiku

Neutropenia

Stan kliniczny, w którym

liczba leukocytów spada

o dwa rzędy wielkości

poniżej limitu

Anemia

Spadek poziomu

eytrocytów


Białka terapeutyczne - przykłady

Białka stymulujące powstawanie komórek krwi

Erytropoetyna

Etapy ERYTROPOEZY

a) krew przenosi za mało tlenu; b) informacja o tym dociera do nerki

c) rozpoczyna się produkcja hormonu erytropoetyny (EPO)

d), e) pod wpływem EPO szpik kostny wytwarza czerwone krwinki


Białka terapeutyczne - przykłady

Białka stymulujące powstawanie komórek krwi

Erytropoetyna

  • Ludzka EPO i rekombinowana ludzka EPO są identyczne pod względem

  • sekwencji aminokwasów,

  • pozycji 2 mostków disiarczkowych,

  • 4 miejsc glikozylacji,

  • struktury drugorzedowej.

Peptyd zawiera 165 aminokwasów, masa cząsteczkowa - 30,4 kDa.

Białko zbudowane jest z 4 alfa helis, które tworzą ścisłą pofałdowana strukturę białka.

Rekombinowane produkty nie różnią się pod względem budowy, można jednak zauważyć ilościowe różnice w glikozylacji.


Erytropoetyna jako LEK

EPO odgrywa bardzo dużą rolę w leczeniu niedokrwistości w przebiegu niewydolności nerek i u osób dializowanych.

Obecnie stosuje się wyłącznie postacie rHu-EPO. Preparaty EPO alfa i beta nie różnią się działaniem leczniczym.

W Polsce dostępne są preparaty o nazwie handlowej Neorecormon oraz Eprex.

Tradycyjnie zalecane jest dawkowanie 3 razy w tyg. podskórnie 150–300 IU/kg.

Znacznie wygodniejszym sposobem podawania leku przy podobnej skuteczności okazało się wstrzyknięcie hormonu raz w tygodniu w dawce 30 tys. IU.

Pacjenci, którzy otrzymują EPO muszą mieć kontrolowany poziom żelaza, ponieważ jego zasoby w organizmie są wykorzystywane do produkcji hemoglobiny.


Erytropoetyna jako LEK

Biorąc pod uwagę przede wszystkim wygodę chorych, a także

usprawnienie pracy personelu medycznego, podjęto próby

wynalezienia preparatów EPO, charakteryzujących się wydłużonym czasem działania, co umożliwić mogłoby podawanie leku w dłuższych odstępach czasu przy zachowanej skuteczności w zakresie wyrównywania niedokrwistości.

MODYFIKACJE:

EPO o zwiększonej liczbie przyłączonych cząsteczek kwasu sialowego.

Modyfikacjia struktury hormonu w taki sposób, aby zmienić jego powinowactwo do receptora dla EPO.

Darbepoetyna

CERA


Białka terapeutyczne - przykłady

Białka stymulujące powstawanie komórek krwi

Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF)

Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów

i granulocytów (GM-CSF)

G-SCF

Glikoproteina, 174 aa, Układy ekspresyjne: CHO, E. coli ; nieglikozylowany także aktywny

Przykładowy lek: Neupogen (Filgrastim), MW 18.8 kDa; nieglikozlylowany; wytwarzany w E. coli

GM-SCF

Glikoproteina, 127 aa; Układy ekspresyjne: CHO, BHK, S. cerevisiae

Przykładowy lek: Leukine (Sagramostim),produkcja w S. cerevisiae; mieszanka trzech form o MW 19,5; 16,8 i 15,5 kDa. W stosunku do ludzkiej rózni się substytucją Leu23 i glikozylacją


Białka terapeutyczne - przykłady

Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty

Stymulacja krzepnięcia

w przypadku zaburzeń krzepliwości o podłożu genetycznym

Hamowanie krzepnięcia

i rozpuszczanie skrzepów

w przypadku np. udaru

mózgu i zawału serca


Białka terapeutyczne - przykłady

Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty

Czynnik krzepliwości IX

Glikoproteina, 415 aa, MW 55 kDa

Przykład produktu: BeneFix; producent CHO

Czynnik krzepliwości VIIA

Glikoproteina, 406 aa, MW 50 kDa

Przykład produktu: NovoSeven; producent BHK, pierwotny produkt

jest wydzielany do pożywki jako pojedynczy łańcuch i następnie

poprzez autokatalityczna proteolizę przekształcany w aktuwną formę

dwułańcuchowa.


Białka terapeutyczne - przykłady

Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty

Hirudyna

Specyficzny inhibitor trombiny wytwarzany przez pijawkę lekarską; 65 aa, MW 7kDa

Przykład produktu: Refludan (Lepirodin). Identyczny z naturalnym białkiem, z wyjątkiem wymiany Leu na Ile na N-końcu i brakiem reszty O-sulfonowej na Tyr63. Wytwarzanie – E. coli

Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA)

Proteaza serynowa zbudowana z 527 aa. Katalizuje reakcję przekształcenia plazminogenu w plazminę trawiącą skrzepy fibrynowe; 5 domen strukturalnych-F, P, EGF, K1, K2. Stosowana w leczeniu fibrynolitycznym ostrego zawału mięśnia sercowego

Produkt: Alteplase, CHO


Białka terapeutyczne - przykłady

Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty

  • Reteplase

  • produkt inżynierii tPA- usunięte 3 domeny

  • 2 naturalne domeny tPA- domena katalityczna P i domena

    K2 zapewniająca specyficznośc rozpoznania fibryny

  • wytwarzana w E. coli

  • brak domen EGF i K1- wydłużony biologiczny okres

    półtrwania

  • brak domeny F1- redukuje powinowactwo do fibryny

  • brak glikozylacji (produkcja w E. coli)

    TNKase

  • wymiana reszt aminokwasów w trzech pozycjach: Thr103 na Asn (generowanie

    nowego miejsca glikozylacji), Asn117 na Gln (usuniecie miejsca glikozylacji), sekwencja 296-299 Lys-His-Arg-Arg wymieniona na Ala-Ala-Ala-Ala.

  • wykazuje przedłużony okres półtrwania, zwiększenie odporności na działanie PAI-1, naturalnego inhibitora tPA-

  • Wytwarzany przez CHO


Białka terapeutyczne - przykłady

Interferony i cytokiny

Glikoproteiny o wielkości 165 - 207 aa, wytwarzane przez ludzkie leukocyty,

o działaniu immunomodulatorowym, antyproliferacyjnym i antywirusowym.

Pięć podstawowych rodzajów: alfa, beta, gamma, omega i kappa, różniących się

wielkością, sekwencja aminokwasową i specyficznością działania.

Rekombinowane inteferony znajdują zastosowanie w leczeniu niektórych chorób

nowotworowych, infekcji wirusowych oraz stwardnienia rozsianego

Mechanizm działania: wiązanie ze specyficznymi receptorami na powierzchni

komórek transdukcja sygnału za pośrednictwem tyrozynowoej kinazy bialkowej

uruchomienie selektywnej ekspresji genów

Producenci: E. coli, CHO. Także wersje PEGylowane


Białka terapeutyczne - przykłady

Hormony

Szereg ludzkich hormonów ma strukturę peptydową lub białkową. Należą do nich

hormony tropowe podwzgórza i przysadki mózgowej, niektóre hormony trzustki

(insulina, glukagon) i wątroby (czynnik wzrostowy insulino-podobny),

Glukagon

Polipeptyd, 29 aa. Produkty: GlucaGen (S. cerevisiae), Glucagon (E. coli)

Ludzki hormon wzrostu - somatotropina

Białko, 192 aa, MW 22kDa. Produkt: Protropin (Somatrem), E. coli, zawiera

dodatkową resztę Met na N-końcu.

Follitropina beta

Bialko dimeryczne, glikoproteina. Dwa łańcuchy; 92 aa i 111 aa

Produkt: Follistim, CHO

Zastosowanie w leczeniu bezpłodności kobiet spowodowanej zaburzeniami

jajeczkowania

Insulina


Insulina

Od 1922 insulina świńska. Problem – różnica w łańcuchu B: Ala30 zamiast Thr

Częściowe rozwiązanie: humanizowana insulina świńska – semisynteza

Obecnie od 1982 - insulina ludzka rekombinowana


Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji

Gensulin (BIOTON)

Konstrukcja genu:

sekwencja kodującaPeptyd B-dipeptyd-Peptyd A-peptyd nośnikowy

Ekspresja w Escherichia coli

Produkt:białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnych

Etapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacja

Półprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymi

Obróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz

przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem A

Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa

Dalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazy

Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95%

Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacja

Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%


Insuliny modyfikowane

Lispro (Humalog) Zmiana w łańcuchu B: 28Pro-Lys29 28Lys-Pro29

Aspart (Novolog) Zmiana w łańcuchu B: 28Pro  28Asp

Glargine (Lantus) Zmiana w łańcuchu A: 21Asn  21Gly

Zmiana w łańcuchu B: dodanie 2 reszt Arg

na C-końcu


Białka terapeutyczne - przykłady

Enzymy

- enzymy, których deficyt jest konsekwencją defektu genetycznego

- enzymy jako terapeutyki (często pochodzenia innego niż ludzkie)


Białka terapeutyczne - przykłady

Enzymy

-

Glukocerebrozydaza

Glikoproteina, 497 aa, enzym lyzosomalny, hydrolizujacy glukocerebrozydy

Deficyt glukocerebrozydazy – choroba Gauchera

Produkt: Imiglucerase, CHO, w pozycji 495 His wymieniona na Arg,

niekompletna glikozylacja – reszty mannozy jako końcowe cukry we

fragmentach oligosacharydowych. Efekt: lepsze wiązanie do makrofagów

Deoksyrybonukleaza I

Glikoproteina, 260 aa, MW 37 kDa. Leczenie objawowe zwłóknienia torbielowatego

Produkt: Pulmozyme, CHO

Asparaginaza

Enzym hydrolizujący asparaginę. Komórki białaczki nie mają zdolności

biosyntezy asparaginy. Podanie asparaginazy chorym na białaczkę powoduje redukcję pozakomórkowej puli asparaginy a w efekcie selektywne zabicie komórek nowotworowych

W leczeniu stosuje się asparaginazy produkowane przez E. coli lub Erwinia chrysantemi. Problem – immunogenność

Produkt: Pegaspargase. PEGylowana L-asparaginaza z E. coli. Kowalencyjnie

przyłaczony PEG 5 kDa. Znacząco zredukowana immunogenność


Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych

PEGylacja - przyłączanie kowalencyjne glikoli polietylenowych do białek terapeutycznych

  • dłuższy okres wchłaniania,

  • zmniejszenie procesu degradacji

    przez proteolizę

  • zmniejszenie antygenowości

  • zwiększenie stabilności termicznej

    i mechanicznej cząsteczki

  • dłuższa eliminacja z organizmu


  • Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych

  • PEGylacja

  • Przykłady stosowanych leków modyfikowanych:

  • PEGylowana deaminanaza ( Adagen )- w terapii genetycznego

    niedoboru deaminazy adenozynowej

  • PEGylowana L-asparaginaza (Oncospar),

    w terapii białaczki limfoblastycznej

  • PEG- Intron (Pegintron- 2001) - w terapii

    chronicznego zapalenia wątroby typu C

  • Pegasys (2002) - w terapii chronicznego

    zapalenia wątroby typu C


  • Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych

  • Białka fuzyjne - zawierają białko terapeutyczne

  • i białkowy fragment dodatkowy

    • zwiększenie masy cząsteczkowej leku powyżej progu nerkowego

    • wykorzystanie specyficznych właściwości przeciwciał

    • dla wzmocnienia ukierunkowanego działania leku

    • wyższa aktywność formy dimerycznej w porównaniu z monomeryczną


Enbrel: białko fuzyjne typu X –Fc

powstałe przez połączenie zewnątrz-

komórkowej domeny receptora TNF ( sTNF )

z rejonem Fc immunoglobuliny

Rys. schemat

immunoglobuliny

1-fragment wiążący

antygen

2- region Fab

3- region Fc


Sposoby podawania leków białkowych

Podawanie domięśniowe i podskórne

Problem konieczności zapewnienia przedłużonego działania

Polimery biokompatybilne, biodegradowalne, nieimmunogenne

PLA – polimleczan

PLGA – poli(D,L-mleczan-co-glikolan)


Sposoby podawania leków białkowych

Implantowana pompa osmotyczna

Przed implantacją system napełnia się

roztworem leku. W miejscu implantacji woda

przenika przez błonę do komory osmotycznej.

Ilość roztworu leku wydzielanego ze zbiornika

odpowiada ilości wody wchodzącej do komory

Taki system zapewnia stały poziom

leku białkowego w osoczu


Sposoby podawania leków białkowych

Samoregulujący się system podawania insuliny


Sposoby podawania leków białkowych

Podawanie doustne


ad
  • Login