Carro, Ana Clara Czysezon, Nicolás Davies Sala, Carol Martinez, Jimena

1. Seminario VII Biología Molecular 2009 Arreglos traslacionales y rotacionales de los nucleosomas con H2A.Z a lo largo del genoma de Saccharomyces cerevisiae Carro, Ana Clara Czysezon, Nicolás Davies Sala, Carol Martinez, Jimena

3. Introducción Nucleosoma: unidad básica de la cromatina Core de dímeros de proteínas histonas alrededor del cual está enrollado el DNA 1.65 veces (-147pb) Histonas: Canónicas: H2A, H2B, H3, H4, sintetizadas en fase S. Variantes: H3.3, H2A.Z, sintetizadas en todo el ciclo celular, asociadas a regiones transcripcionalmente activas. Fuera del core: H1 (linker) La cola N-terminal emerge del core, a través del DNA. Está sujeta a modificaciones (acetilación, metilación)

4. Existen dos relaciones DNA- nucleosoma Arreglo traslacional: define el midpoint del DNA relativo a un locus Puede estar posicionado dentro de un pequeño rango (Phased) o con una distribución continua (Fuzzy) Arreglo rotacional: define la orientación del DNA en la superficie de la histona

5. ¿Cómo puede la cromatina interferir en la expresión génica? 1) Posicionamiento de nucleosomas (importancia en zonas promotoras). 2) Modificación post-traduccional de histonas (metilación, acetilación). 3) Cambio en la composición bioquímica de nucleosomas por reemplazo de histonas canónicas por histonas variantes (H2A.Z)

6. Preguntas 1. ¿Cuáles son las características del posicionamiento del DNA in vivo? 2. ¿Cuántos arreglos traslacionales y rotacionales ocupa el nucleosoma? 3. ¿Los elementos cromosomales poseen una arquitectura cromatínica específica? 4. ¿Cuál es la relación topológica entre la localización de los elementos promotores y los arreglos rotacionales y traslacionales de los nucleosomas?

8. Metodología Aislamiento y purificacióndel DNA nucleosomal.

9. Selección del DNA

11. Resultados Distribución del DNA nucleosomal con H2A.Z → Región arbitraria del genoma →Se observan regiones enriquecidas en nuclesomas con H2A.Z →Regiones con baja señal para H2A.Z, ¿Poseen función biológica? ↓ Análisis regiones de rDNA → Determinan que no posee función biológica

12. -1 0 +1 1 bp 147 bp MIDPOINT Punto medio (MIDPOINT)

13. Detalle de UN nucleosoma Eje X: posisción en el genoma del punto medio de este nucleosoma en cada individuo secuenciado. Eje Y: cantidad de individuos que poseen el punto medio en esa posiciòn →Distancia entre puntos medios da idea de la periodicidad traslacional →Largo de la región total abarcada por los puntos medio da idea de la dispersiòn total del nucleosoma (fuzziness)

14. Desvío standard en cadena Watson vs cadena Crick Cada punto representa el DS del Midpoint de un nucleosoma (se calcula contemplando el punto medio obtenido para ese nucleosoma en cada uno de los genomas individuales secuenciado) • Nucleosomas que poseen: • ↑DS en cada cadena poseen mayor dispersión y por ende su ubicaciòn traslacional es màs difusa (fuzziness) • ↓ DS en ambas cadenas, estàn localizados

15. Examinaron más de 8000 nucleosomas bien posicionados Observaron patrón de dinucleótidos AA/TT y GC Enriquecimiento GC y deficiencia AT en 3-4 pb desde el borde del nucleosoma Donde emerge del DNA la cola H3 Deficiencia AT no es evidente hasta luego de 1pb del borde La especificidad de MNasa no depleta de AT los bordes

16. Midieron distancia pico-pico entre los arreglos translacionales adyacentes Periodicidad de 10 pb de los dinucleótidos Esto restringe al DNA a un único arreglo rotacional que resulta en arreglos translacionales discretos en cuantos de 10 pb

17. Mas experimentos… Contienen TATA, regulados positivamente por factores remodeladores de la cromatina, negativamente por factores modificadores de histonas Genes con nucleosomas H2A.Z muy “fuzzy” Reposicionamiento de nucleosomas por reguladores de cromatina tiene rol en la regulación de expresión génica

18. Distribución de nucleosomas H2A.Z respecto de los elementos cromosómicos Regiones teloméricas y centroméricas con nucleosomas H2A.Z en posiciones fijas espaciadas a 200 pb. Nucleosoma centromérico especializado sin H2A.Z H2A quizás?

19. Distribución de nucleosomas H2A.Z respecto de los elementos cromosómicos Orígenes de replicación (ARSs) sin nucleosomas H2A.Z éstos estaban flanqueándolos

20. Distribución de los nucleosomas H2A.Z respecto de los elementos cromosómicos Promotores sin TATA: espaciamiento canónico de nucleosomas (165 pb.) Promotores con TATA: distribución no canónica

21. Y además… Genes con distintos niveles de transcripción Posicionamiento traslacional de nucleosomas siempre sobre el ORF Niveles de H2A.Z reducidos depleción de nucleosomas

22. Distribución de los elementos regulatorios de la transcripción a lo largo de la superficie del nucleosoma. a.- la región TATA está distribuida a lo largo del borde río abajo del primer nucleosoma río arriba. b.- la región TSS está concentrada en el borde río arriba del nucleosoma +1, el cual tiende a ser menos “fuzzy” que otros nucleosomas.

23. Distribución de las regiones conservadas de unión a los factores de transcripción (TF). c.-Los sitios de unión a TF están localizados cerca de los bordes de los nucleosomas y están concentrados a una distancia de 10 pb. entre ellos y concuerdan con la zona que se expone del nucleosoma (surco mayor del DNA) en el arreglo rotacional. d.-Los sitios a los cuales se unen los TF están localizados cerca de los bordes de los nucleosomas, lo que sugeriría que una consecuencia de la unión de los TF provocaría un desplazamiento traslacional del nucleosoma.

24. Modelo propuesto Representación del arreglo rotacional de los sitios de unión a lo TF y TSSs sobre la superficie del nucleosoma.

25. Conclusiones • Se pudo establecer un mapa nucleosomal para H2A.Z a lo largo del genoma de S. cerevisiae • Se determinó una alta localización de H2A.Z en la región 5´de zonas trancripcionalmente activas. También está presente en otros elementos cromosomales como telómeros y centrómeros • Existe una periodicidad de dinucleótidos AA, TT, AT y TA en contrafase con dinucleotidos GG, CC, GC y CG, cada 10 bp. Esta periodicidad restringe al DNA a un único arreglo rotacional y limita a cuantos de 10 bp el arreglo traslacional • Los nucleosomas con H2A.Z pueden estar traslacionalmente posicionados o dispersos (fuzzy). • Los promotores con TATA box contienen los nucleosomas fuzzy mientras que aquellos sin TATA poseen los nucleosomas posicionados. • Los nucleosomas se ubican dispersos en el borde upstream de las cajas TATA, mientras que el nucleosoma del sitio de inicio de la transcripción (TSS) está posicionado. • Los sitios de unión para los factores de transcripción se ubican en los surcos mayores de la superficie externa del nucleosoma distal.

26. Gracias!