titre

1. titre IMMUNOLOGIE

2. * 1. Rappels: les origines cellulaires. 2. Structure. * 2.1. Structure de base. plan 1-2 * 2.2. Classes d’immunoglobulines. 2.3. Site de reconnaissance. * 2.3.1. Structure du paratope. * 2.3.2. Organisation des domaines V. * 2.4. Remarque: AC particuliers.

3. 3. Diversité des anticorps. 3.1. Recombinaison des chaînes légères. * 3.1.1. Principe. * 3.1.2. Mécanisme. 3.2. Recombinaison des chaînes lourdes. plan 3 * 3.2.1. Principe. * 3.2.2. Mécanisme. 3.2.3. Commutation de classe. * 3.2.3.1. Switch. * 3.2.3.1. Commutation m / d. 3.3. Diversité additionnelle. * 3.3.1. Variabilité de recombinaison. 3.3.2. Mutation somatique.

4. 4. Anticorps: outil d’analyse. * 4.1. Immuno-précipitation. plan 4-5 * 4.2. Méthodes immuno-enzymatiques.

5. 4. Anticorps: outil d’analyse. * 4.1.1. Complexe immun et précipitation. * 4.1. Immuno-précipitation. 4.1.2. Précipitation en milieu liquide plan 4.1 * 4.1.2.1. Centrifugation. 4.1.2.2. Ring test. 4.1.2.3. Néphélométrie. 4.1.3. Précipitation en milieu gélifié. * 4.1.3.1. Principe. * 4.1.3.2. Diffusion simple: Mancini. * 4.1.3.3. Diffusion double: Outcherlony. 4.1.3.4. Immuno-électrophorèse. * - simple * - Electrosynérèse * - Electrophorèse en fusée. * 4.1.4. Précipitation provoquée. PLAN

6. 4. Anticorps: outil d’analyse. * 4.2.1. Principe. * 4.2.1.1. Couplage AC-Ez. * 4.2.1.2. Réactions utilisées. plan 4.2 * 4.2.2. Méthodes qualitatives. * 4.2. Méthodes immuno-enzymatiques. 4.2.3. Méthodes quantitatives. * 4.2.3.1. Classification. 4.2.3.2. Méthodes directe . * ELISA direct (phase hétérogène) * ELISA sandwich (phase hétérogène) * ELISA double sandwich (phase hétérogène) * EIMA (phase homogène + hétérogène) 4.2.3.3. Méthodes avec compétition. * Dosage Ag * Dosage AC * EMIT PLAN

7. * 1. Rappels: les origines cellulaires. Immunité cellulaire 1. Cellimm Thymus Lymphocyte T Lignée lymphoïde anticorps Cellules souches Immunité humorale PLAN Lymphocyte B plasmocyte

8. ponts disulfures d’une immunoglobuline. chaîne légère l et k * 2.1. Structure de base 2.1 struct chaîne lourde m, g, d, a et e fragment Fab fragment Fc

9. La structure et le rôle des différentes partie d’un immunoglobuline ont été étudiés par hydrolyse enzymatique ménagée. * 2.1. Structure de base d’une immunoglobuline. 2.1 cliv PLAN

10. 2.2 classe * 2.2. Classes d’immunoglobulines. PLAN

11. liaisons électrostatiques Ag liaisons van der Waals liaison hydrogène PLAN 2.3.1 site R 2.3. Site de reconnaissance. * 2.3.1. Structure du paratope. La structure 3D définie une cavité de forme complémentaire de l’Ag. Les deux sites de reconnaissances sont identiques: mêmes domaines variables léger et lourd. Complémentaire de forme et de charge.

12. Variabilité de la séquence des gènes du domaine variable de la chaîne légère. 3 domaines hypervariables = CDR « ComplementaryDeterminingRegions » 2.3.2 orga V 2.3. Site de reconnaissance. Ces 3 domaines correspondent à 3 replis peptidiques définissant l’espace du site de reconnaissance. 4 segments intermédiaires: FR « Frameworks » = régions charpentes * 2.3.2. Organisation des domaines V. Variabilité de la séquence des gènes du domaine variable de la chaîne lourde. 3 domaines hypervariables 4 segments intermédiaires PLAN

13. : les AC de lama. PLAN Les lamas possèdent, en plus des AC conventionnels, une sous classe d'AC dépourvus de chaîne légère. Les domaines variables des chaines lourdes contiennent à eux seuls le site de reconnaissance de l'Ag. ils sont nommés SdAbs ("Single Domain Antibodies") 2.4 nanobodies Les intérêts de ce type d'AC sont multiples: Ils sont aisément clonables et produits par E.coli Le domaine variable peut-être séparé du reste de la molécule et former un nanobodie (= nano-antibodie). On dispose ainsi d'un paratope stable (les conditions intra-cytoplasmiques sont réductrices) et de petite taille que l'on peut introduire à l'intérieure même des cellules. Ils possèdent une forte homologie avec les AC humains: leur immunogénicité est donc réduite. * 2.4. Remarque: AC particuliers Ils sont stables et ne réagissent pas en milieu réducteur (pas de pont disulfure). Ils sont utilisés: pour la localisation in situ d'Ag spécifiques comme agents bloquants métaboliques

14. L: séquence signal (leader) V: séquence domaine variable J: séquence jonction k: séquence domaine constante 3.1. Recombinaison des chaînes légères. ADN * 3.1.1. Principe. 3.1.1 géne L coupure et ligature ARNm Transcription et épissage protéine Traduction et maturation PLAN

15. 3.1. Recombinaison des chaînes légères. * 3.1.2. Mécanisme. 3.1.2 méca L PLAN

16. L: séquence signal (leader) V: séquence domaine variable J: séquence jonction D: séquence de diversité m, d, g, e, a : séquences des domaines constant C’est vraiment tout petit comme argument. Et l’animation? C’est quoi cette arnaque? 3.2. Recombinaison des chaînes lourdes. 3.2.1 gène H * 3.2.1. Principe. T’es gentille, mais tu sais combien de temps ça prend? Au fait, je me demandais: est-ce que tu peux rougir? Peut-être, mais moi j’ai cinq doigts! Ce n’est pas une raison! PLAN

17. 3.2. Recombinaison des chaînes lourdes. 3.2. Recombinaison des chaînes légère.. * 3.2.2. Mécanisme. 3.2.2 méca Let H PLAN

18. PLAN gène avant commutation IgM & IgD 3.2. Recombinaison des chaînes lourdes. 3.2.3.1 comm cl gène après commutation 3.2.3. Commutation de classe. * 3.2.3.1. Switch. IgG-3 IgE IgA

19. PLAN ADN ARN 3.2. Recombinaison des chaînes lourdes. 3.2.3.2 comm m/d ARNm IgM circulant épissage 3.2.3. Commutation de classe. * 3.2.3.1. Commutation m / d. ARNm IgM membranaire épissage ARNm IgD épissage

20. chaîne légère La diversité ne provient pas uniquement de la combinaison aléatoire des différents types de séquences codons modifiés 3.3.1 var recomb Elle résulte également des « erreurs » de coupures au cours de l’excision. Elles provoquent des « délétions » ou des « insertions » ainsi que des modifications de codon. Les termes dérivés de la mutagénèse (délétion, insertion) ne sont pas adaptés. Les recombinaisons ne sont pas des mutations car les variations qu’elles induisent ne sont pas transmissibles d’une génération (au niveau des organismes, pas de la lignée cellulaire) à l’autre. codon supprimé chaîne lourde codon additionnel * 3.3.1. Variabilité de recombinaison. PLAN

21. AC libres AC non saturés AC saturés * 4.1. Immuno-précipitation. 4.1.1. Complexe immun et précipitation. 4.1.1 Formation d’un réseau Précipitation PLAN

22. Tampon Ag AC 4.1.2. Précipitation en milieu liquide 4.1.2.1 centri * 4.2.2.1. Centrifugation. centrifugation Excès AC Excès Ag culot Ag/AC

23. PLAN masse culot zone d’équivalence 4.1.2. Précipitation en milieu liquide 4.1.2.1 centri suite * 4.1.2.1. Centrifugation. qt d’Ag courbe « lapin » masse culôt zone d’équivalence courbe « cheval » qt d’Ag

24. 4.1.3.1 principe gel 4.1.3. Précipitation en milieu gélifié. 4.1.3.1. Principe. gradient de [ Ag ] gradient de [ AC ] PLAN

25. PLAN Immunodiffusion radiale simple 4.1.3.2 Mancini AC coulé dans le gel puits creusés dans le gel remplis d’Ag (C variables) D2 Diffusion de l’Ag -----> précipitation au point d’équivalence * 4.1.3.2. Diffusion simple: Mancini. D2 = a . C + b C Ag

26. Immunodiffusion radiale double identité -----> arcs se prolongent préparer le gel Diffusion 4.1.3.3 Outcherlony creuser les puits verser Ag AC Formation d’un arc de précipitation dans le zone d’équivalence pas d’identité -----> arcs se coupent * 4.1.3.3. Diffusion double: Outcherlony. identité partielle PLAN

27. Préparer la lame Creuser les puits Les remplir d’Ag Appliquer le champ électrique -----> séparation des Ag Creuser une gouttière Verser l’AC Laisser diffuser (24 h) Formation des arcs de précipitation 4.1.3.4 immuno-électr 4.1.3.4. Immuno-électrophorèse. * - simple PLAN

28. PLAN Electrosynérèse Electrosynérèse 4.1.3.4 Electrosynérèse - fusées Electrophorèse en fusée Electrophorèse en fusée 4.1.3.4. Immuno-électrophorèse.

29. PLAN Méthode mise au point dans le cas de complexes ne donnant pas de réseau (pas de précipitation). On utilise des réactifs qui provoquent la précipitation. 4.1.4 précprov polyéthylène glycol (PEG) = précipitation Ag-AC charbon actif ("dextran-coatedcharcoal") = précipitation Ag libre Le dextran est un polymère de sucre qui entoure le charbon et évite que les grosses protéines (et AC) soient adsorbées Cette méthode n’est valable uniquement sur les petites molécules (Haptènes, hormones stéroïdiennes,...) Ce dosage peut-être quantitatif grâce à l’utilisation de traceurs (molécules marquées par radioactivité par exemple) * 4.1.4. Précipitation provoquée.

30. * 4.2. Méthodes immuno-enzymatiques. Ces méthodes permettent de mettre en évidence la présence d’un complexe Ag-AC grâce à une réaction enzymatique. 4.2.1. Principe. 4.2.1 principe Ag Substrat chromogène Enzyme PLAN

31. Le couplage consiste à fixer l’enzyme sur l’anticorps ou l’antigène à l’aide de molécules adaptées. * 4.2. Méthodes immuno-enzymatiques. * 4.2.1.1. Couplage AC-Ez. Couplage directe utilisation d’un réactif bi-fonctionnel 4.2.1.1 couplage glutaraldéhyde CHO - (CH2)3 – CHO (liaison covalente entre 2 amines) Prot-N ----(glutaraldéhyde)------N – Ez utilisation de 2 molécules présentant une affinité l'une pour l'autre Couplage indirecte système biotine - avidine Prot - biotine - - - - - - - avidine - Ez PLAN

32. * 4.3.1.2. Réactions utilisées. 4.2.1.2 réactutil C’est de quelle couleur? U.V. PLAN

33. PLAN * 4.2. Méthodes immuno-enzymatiques. Cytologie Biochimie Mise en évidence d’Ag spécifiques sur une coupe tissulaire. Mise en évidence d’Ag après séparation par électrophorèse. 4.2.2 * 4.2.2. Méthodes qualitatives. Mise en évidence de la kératine du cytosquelette Révélation d’un Western blot par chimioluminiscence

34. 2 caractéristiques: dosage grâce à une gamme préparée par dilution sériée (ordre 2) méthodes directes ou par compétition addition d’un Ag de même spécificité (compétiteur) 4.2.3.1 class Type de support: phase homogène phase hétérogène 4.2.3. Méthodes quantitatives. AC et Ag sont mélangés dans une même solution. Les AC sont fixés sur un support (bille, paroi d’un puits,...) 4.2.3.1. Classification. Utilisation de techniques de séparation (centrifugation,...) pour doser séparément complexe immun et ligand libre. Nécessite un "lavage" pour éliminer les ligands libres avant le dosage. PLAN

35. Sensibilation Principe des calculs lavage + AC à doser lavage L’antigène (à doser) est dilué au cours de la sensibilisation. 4.2.3.2 ELISA direct L’antigène libre est incubé dans une microplaque. De petites quantités se fixent (adsorption) sur la surface plastique + Enzyme lavage Le dernier puits positif indique la limite de sensibilité + Substrat * ELISA direct (phase hétérogène) développement Tous les derniers puits positifs présentent la même concentration d’AC On compare la dilution de tous les derniers puits positifs: avec une valeur connue (standard) avec un étalon (gamme)

36. Exemple de calculs dilution limite Etalonnage Dilution sériée d'ordre 2 témoins 1/D 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 - + 4.2.3.2 ELISA sandwich calculs Etalon 150 UI échantillon Céch = 1,17 x 512 = 600 UI limite de sensibilité C = 150 / 128 = 1,17 UI PLAN

37. Sensibilisation -----> fixation des AC + lavage + Ag à doser + lavage 4.2.3.2 ELISA sandwich + AC marqués + lavage + Substrat -----> développement * ELISA sandwich (phase hétérogène) L’Ag doit posséder 2 épitopes

38. PLAN Sensibilisation -----> fixation des AC + lavage + Ag à doser + lavage 4.2.3.2 ELISA double sandwich + AC + lavage + ACanti AC marqué + lavage * ELISA double sandwich (phase hétérogène) + Substrat -----> développement

39. (Immunoenzymometricassay) fixation C Ag à doser PLAN Phase homogène Ag à doser + AC-Ez Phase hétérogène (Ag adsorbé sur puits) 4.2.3.2 EIMA Ag/AC-Ez + AC-Ez -----> AC libre se fixe lavage + Substrat -----> développement * EIMA (phase homogène + hétérogène) Principe des calculs On compare les pentes des droites de différents échantillons (inconnu et étalon). Le rapport des pentes est égal au rapport des concentrations. C Ag à doser > AC / Ag > AC libre < AC fixé sur plaque <

40. Exemple de calculs PLAN 4.2.3.2 EIMA calculs L'Ag réagit avec AC-Ez et en laisse libre une partie Les valeurs sont arbitraires en considérant une Ci de AC-Ez = 90 UI Cét / Céch = aét / aéch Céch = Cét x aéch / aét Etalon 150 UI Abs Echantillon Céch = 150 x 0,048 / 0,012 = 600 UI [Ag] en UI

41. fixation C Ag à doser PLAN AC fixés + Ag - Ez + Ag à doser 4.2.3.3 Ag compétition -----> fixation compétitive + lavage + Substrat -----> développement Principe des calculs On compare les pentes des droites de différents échantillons (inconnu et étalon). Le rapport des pentes est égal au rapport des concentrations. 4.2.3.3. Méthodes avec compétition. C Ag à doser > AC / Ag > AC libre < AgEz fixé sur plaque < * Dosage Ag

42. fixation C AC à doser PLAN Ag fixés + AC - Ez + AC à doser 4.2.3.3 AC compétition -----> fixation compétitive + lavage + Substrat -----> développement 4.3.3.3. Méthodes avec compétition. C AC à doser > AC - Ez / Ag < * Dosage AC

43. fixation C Ag à doser Addition haptène – Ez + Ag à doser Enzyme MultipliedImmunoassay Technique conjugué haptène - enzyme Principe des calculs 4.2.3.3 EMIT 1 haptène-Ez La présence des Ag à doser libère les enzymes et leur rend leur activité. Incubation Compétition pour AC NB: pas d’étape de lavage Addition du substrat La fixation sur l’AC inactive l’enzyme (blocage de la réaction enzymatique) 4.3.3.3. Méthodes avec compétition. * EMIT

44. fixation C Ag à doser 4.3.3.3. Méthodes avec compétition. * EMIT conjugué haptène - substrat incubation haptène - S Ag à doser Principe des calculs 4.2.3.3 EMIT 2 haptène-S La présence de l’Ag libère le substrat et permet l’activité de l’enzyme. Compétition pour AC NB: pas d’étape de lavage La fixation sur l’AC masque le substrat (blocage de la réaction enzymatique)

45. fixation C Ag à doser 4.2.3.3. Méthodes avec compétition. * EMIT PLAN conjugué haptène - Inhibiteur incubation haptène - I Ag à doser Principe des calculs 4.2.3.3 EMIT 3 haptène-I La présence de l’Ag libère l’inhibiteur Compétition pour AC NB: pas d’étape de lavage La fixation sur l’AC masque l’inhibiteur (blocage de l’inhibition enzymatique)