Immunoloogilised meetodid

1. Immunoloogilised meetodid Lahutusmeetodid, sügis 2011

2. Immunoloogilisedmeetodid • Sissejuhatus immunoloogiasse • Antigeenid ja antikehad • Klonaalse selektsiooni teooria • Antikehade valmistamine • Immunoanalüütilised meetodid • Western Blotting • Immunosadestamine • Immunofluorestsents • Immunotsütokeemia, immunohistokeemia • ELISA test • Radioimmunotest

3. Organismi kaitsemehhanismid võõrkehade vastu • Mehhaaniline kaitse: nahk • Põletikuline reaktsioon: purustatud kudedesse toimub suurenenud verevool ja leukotsüüdid (valged verelibled) elimineerivad võõrkehad • Immunoloogiline reaktsioon: lümfotsüüdid (valgete vereliblede hulgas 25-40 %) sünteesivad antikehasid ja rakke spetsiifiliste omadustega ära tunda ja siduda võõrkehasid

4. Immuunvastuse tekkes osalevad • B-lümfotsüüdid toodavad antikehi • T-lümfotsüüdid abistavad neid ja tapavad organismi viirusnakatunud rakke • Teised rakutüübid – dentriitrakud võimaldavad T-lümfotsüütidel antigeeni ära tunda • Makrofaagid ja neutrofiilid hävitavad (fagotsüteerivad) organismi tunginud patogeene

5. Antigeenid ja antikehad • Antikehad on proteiinid, mis produtseeritakse loomades vastusreaktsioonina võõrkehade tungimisele kudedesse • Inimorganismis leidub vähemalt 107 erineva äratundmis-spetsiifikaga antikehade tüüpi • Võõrkehad on antud kontekstis tuntud kui antigeenid • Antikehad on võimelised ära tundma ja siduma antigeene • Antikehade analüütiline kasutamine rajaneb asjaolul, et nad on võimelised siduma ainult neid antigeene, mille jaoks on nad sünteesitud: seega on võimalik vastavaid antigeene spetsiifiliselt ülejäänud segust eraldada

6. Immunoloogiline vastusreaktsioon: kaks klassi Rakuline vastus Humoraalne vastus Antigeen T-Lümfo-tsüüdid B-Lümfo-tsüüdid Võõraid rakke keemiliselt hävitavad rakud Antikehasid tootvad rakud Imetaja B-lümfotsüüdid arenevad luuüdis, T-lümfotsüüdid aga tüümuses. Rakurühmade tähistus tuleneb vastavate organite ingliskeelsetest nimetustest: B (bone marrow) ja T (thymus).

7. Klonaalne selektsioon • Spetsiifiliste retseptoritega antikehad ja lümfotsüüdid vastavate antigeenide sidumiseks eksisteerivad organismis juba enne esimest kontakti antigeeniga • Ainult vähesed lümfotsüüdid, mis suudavad ära tunda parasjagu ründavat patogeeni (antigeeni), aktiveeritakse paljunema ja tootma antikehasid • Individuaalne lümfotsüüt toodab antikehi, mis on võimelised ära tundma ainult üht kindlat antigeeni • Lümfotsüüdi paljunemisel tekkvad rakkude kloonid ehk rakupopulatsioon, mis hakkab tootma vaid erispetsifilisi antikehasid vastavalt esialgse lümfotsüüdi programmile

8. Klonaalne selektsioon Selektiivne aktivatsioon Kloonide paljunemine Plasmaatilisedrakud Antikehade süntees paratoop Antigeen epitoop

9. Antikeha struktuur • Antikehad on immunoglobuliinid (Ig) (20% vere summaarsest valgust) • Kaks kerget L (23kD) ja kaks rasket H (50-75 kD) peptiidahelat • Ahelaid seovad disulfiidsidemed • Varieeruvad piirkonnad V eristavad antigeeni • Konstantne piirkond C määrab isotüüpi/funktsiooni VH VH CH VL VL CL CL CH CH

10. Antikeha suurus teiste osakestega võrreldes

11. Antigeen-antikeha reaktsioonid • Antikeha seob antigeeni elektrilise või hüdrofoobset tüüpi nõrga interaktsiooniga, mis ei ole keemilise sideme tüüpi ning oleneb antikeha ja antigeeni omavahelisest kujust • Antikehad võivad reageerida ka mittespetsiifiliselt, “võõraste” antigeenidega, nähtus on tuntud kui kross-reaktiivsus • Antigeen-antikeha • reaktsioon on • tasakaaluline

12. Antikehade valmistamine • Loomale (meresiga, küülik, hobune, kits) süstitakse puhast antigeeni • Antigeeni allikas, loom, peab erinema võimalikult palju antikeha tootvast loomast • Loom hakkab peale antigeeni manustamist tootma nn polüklonaalseid mittespetsiifilisi antikehasid • Sellegipoolest võib eeldada, et individuaalne lümfotsüüt toodab ainult ühe spetsiifikaga antikehasid • Monoklonaalne antikeha saadakse, paljundades ühte-ainukest lümfotsüüti, mis on võetud katselooma põrnast (ik spleen) pärast antikehade manustamist

13. Polüklonaalsete antikehade valmistamine • Loomale süstitakse puhast antigeeni • Loom hakkab peale antigeeni manustamist tootma antikehasid • Seerum ekstraheeritakse • Seerumis on polülkonaalsete antikehade heterogeenne segu

14. Monoklonaalsete antikehade valmistamine • Loomale süstitakse puhast antigeeni • Katselooma põrnast eraldatakse lümfotsüüdid • Lümfotsüüdid seotakse teatud vähirakkudega (myeloma cells) • Moodustuvad hübridoomid- lümfotsüüdi ja vähi raku hübriidid • Koos lümfotsüüdi geneetilise infoga hakkab hübridoom valmistama spetsiifilist (monoklonaalset) antikeha

15. Monoklonaalsete antikehade valmistamine 1984.a. Nobeli preemia meditsiinis - Georges Köhler, César Milstein, Niels Jerne • Suspensiooni lahjendatakse, kuni katseklaasi jääb üksainuke rakk, millest hakatakse kasvatama rakukultuuri, mis on võimeline sünteesima kindlat tüüpi antikehasid • Antikehasid sünteesitakse suures koguses edasi juba esialgse rakukultuuri kasvatamisega, näit kasvajana loomal

16. Polüklonaalsed ja monoklonaalsed antikehad: eelised ja puudused • Polüklonaalsed • Aktiivsus säilib epitoobi konformatsiooni muutusel • Odavad • Suhteliselt kiire tootmine • Tehniliselt lihtne • Madal korratavus • Kross-reaktiivsed • Piiratud saadavus • Monoklonaalsed • Hea korratavus • Spetsiifilised • Piiramatult saadavad • Tundlikud epitoobi konformatsiooni muutusele • Kallid • Aeganõudev tootmine • Tehniliselt keeruline

17. Antikehade modifikatsioonid ELISA, Western Blotting Immunohistokeemia Immunosadestamine ELISA, immunohistokeemia

18. Tehniline terminoloogia VL

19. Western Blotting Immuno-analüütilised meetodid • Antigeenide (valkude) segu lahutatakse elektroforeetiliselt geelil (geelile ilmuvad analüütide lahutatud ribad) • Geelilt kantakse antigeenid elektroforeetiliselt üle nitrotselluloosist membraanile (100 V, geel ja membraan pannakse kahe elektroodi vahele) • Membraanile transformeeritud antigeenide ribadele lisatakse kindlat antikehade lahust testimaks vastavate antigeenide olemasolu

20. Western Blotting Immuno-analüütilised meetodid PKM - pyruvate kinase muscle isozyme Western Blotting – spetsiifilised valgud Southern Blotting – DNA Nothern Blotting – RNA Eastern Blotting – valkude posttanslatoorsed modifikatsioonid

21. Immunosadestamine Immuno-analüütilised meetodid Antigeen-antikeha kompleksite sadestamine • Kui segada sobivas proportsioonis antigeen ja antikeha, siis tekib võre tüüpi struktuur, mis sadestub ja muutub seega detekteeritavaks • Oluline sademe moodustumisel on Ag ja Ab täpne suhe.

22. Immunosadestamine Immuno-analüütilised meetodid Sademe hulga sõltuvus Ag kontsentratsioonist Maksimaalne sadestamine toimub kui antigeeni ja antikeha kogused on stöhhiomeetrilised (ekvivalentsed), sellisel juhul tekkiv võre tüüpi struktuur sadestub. Ekvivalentse tsooni mõlemalt poolt sademe kogus väheneb, sest tekkivad kompleksid on väiksemad ning lahustuvad paremini.

23. Immunosadestamine Immuno-analüütilised meetodid Sadestamine lahuses: Mõõdetakse lahuse hägusust • Valmistatakse erinevate Ag kontsentratsioonidega kalibreerimis-lahused. Mõõtes nefelomeetri abil Ab liiaga lahuse valguse hajumise intensiivsust saadakse kalibreerimissirge, mida on hiljem võimalik kontsentratsioonide määramisteks kasutada. Meetod on ebatäpne. Valguse hajumise intensiivsuse ehk lahuse häsususe mõõtmine nefelomeetriga

24. Immunosadestamine Immuno-analüütilised meetodid Sadestamine lahuses: Antigeen isoleeritakse lahusest edasi analüüsiks Lisada 1⁰ antikeha Lisada tahked osakesed (magnetid) Tsentrifuugida (magnetiseerida) ja eemaldada supernatant Antigeeni sisaldav proov Natiivne antigeen (enne SDS-PAGE)

25. Immunosadestamine Immuno-analüütilised meetodid Sadestamine geelis: radiaalne immunodiffusioon • Antikehasid sisaldavasse geeli lõigatakse augud, kuhu sisestatakse antigeeni lahuseid • Ööpäeva jooksul diffundeeruvad antigeenid geelis: meetodi suureks puuduseks on ajakulu • Iga augu ümber tekib sademe ring, mille pindala on võrdeline antikeha kontsentratsiooniga • Näide: saab määrata albumiini kontsentratsiooni geelil, mis sisaldab 10% antikehasid inimese albumiini vastu

26. Immunotsütokeemia Immuno-analüütilised meetodid Antigeeni kujutamine elusrakkudes Markerid: fluorestsentsvärvid (rhodamine, fluorescein), ensüümid (peroksidaas, leeliseline fosfotaas)

27. Immunohistokeemia Immuno-analüütilised meetodid Antigeeni kujutamine fikseeritud kudedes

28. Immunohistokeemia Immuno-analüütilised meetodid

29. Immunotest (ik immunoassay) Immuno-analüütilised meetodid • Konkureeriv immunotest kasutab märgistatud ja märgistamata Ag konkurentsi teatud ning piiratud arvu antikehade hõivamisel. Kui [Ab] ja [Ag*] on teada, saab leida [Ag] mõõtes [Ag*Ab] signaali vähenemist võrreldes olukorraga, mis on mõõdetud siis kui Ag puudub • Mittekonkureeriv immunotest kasutab olukorda, kus märgistatud Ab* on liias ja [Ag Ab*] signaali mõõtmine annab kohe Ag signaali • Antikehad ja antigeenid tuleb ära märkida ja komponendid Ag, Ag*, [AgAb] ja [Ag*Ab] tuleb enne mõõtmist lahutada

30. Immunotest (ik immunoassay) Immuno-analüütilised meetodid • Antikeha • Marker ehk märgistav ühend (ik label) • Kalibreerimise standardlahused • Pärast immunoreaktsiooni lahutatakse seotud ja sidumata kompleksid ja mõõdetakse erinevate ühendite kontsentratsioonid Immunotesti komponendid

31. Immuno-analüütilised meetodid Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay (ELISA) Antigeeni või antikeha kvalitatiivne või kvantitatiivne määramine keerulises segus • ensüümide kasutamisel mõõdetakse reaktsiooni kiirust, kus ensüüm katalüüsib mingi substraadi reaktsiooni • reaktsiooni kiirus on võrdeline ensüümi (st ka Ag) kontsentratsiooniga • populaarne ensüüm on mädarõika peroksüdaas (ik. horseradish peroxydaze) “Sandwich” meetod Wash Wash Wash Antikeha kinnitakse tahkele pinnale Lisatakse antigeen (puhastatud või segu) Lisatakse ensüümiga märgistatud Ab Lisatakse substraat

32. Immuno-analüütilised meetodid ELISA näide: Kas Te olete rase? hCG – human chorionic gonadotropin R tsoon sisaldab ensüümiga märgistatud antikeha T tsoon sisaldab kinnipüüdvat antikeha (sandwich’i moodustamine) C - kontroll

33. Immuno-analüütilised meetodid ELISA variatsioonid Kaudne (i.k. indirect) ELISA • Antigeenimmobiliseeritakse pinnale • Lisatakse primaarne antikeha (patsiendi seerum), mis seob spetsiifiliselt antigeeni • Lisatakse sekundaarne ensüümiga märgistatud antikeha • Lisatakse substraat • Ensüüm katalüüsib substraadi reaktsiooni ning tekib värviline produkt • Mida kõrgem antikeha kontsentratsioon uuritavas seerumis, seda tugevam värvi muutus

34. Immuno-analüütilised meetodid ELISA variatsioonid Konkureeriv ELISA ELISPOT Antigeen-1 inkubeeritakse märgistatud antikehaga enne lisamist antigeeniga-2 kaetud viaalile Nõrgem värv = parem seostumine antigeeniga-1 Antigeeni ekspresserivate rakkude määramine

35. Radioimmunotest (RIA) Immuno-analüütilised meetodid Antigeeni kvalitatiivne või kvantitatiivne määramine keerulises segus Mida nõrgem signaal, seda rohkem märgistamata antigeeni proovis Wash Wash Wash Viaal kaetakse antikehaga Lisatakse 125I-märgistatud antigeen ülehulgas Lisatakse proov (puhastatud või segu) Signaal fikseeritakse gamma lugeja abil 1977 a. Rosalin Yalow Nobeli preemia meditsiinis – RIA insuliini määramiseks

36. Radioimmunotest (RIA) Immuno-analüütilised meetodid Radioaktiivsed isotoobid märgistitena • Kovalentselt seotav väline märgistaja, 125J, mida tihti asendatakse türosiini aromaatsesse ringi • võib muuta märgistatava molekuli struktuur nii, et see kaotab aktiivsuse • Sisemised markerid (14C ja triitium (3H)) asendavad vastavaid molekule Ag või Ab struktuuris • C14 ja triitiumi radioaktiivsel lagunemisel tekkiv γ-kiirgus on nõrk

37. Meetodite kokkuvõte Immuno-analüütilised meetodid

38. Immunotesti komponendid Immuno-analüütilised meetodid Luminofoorid märgistitena • Kasutatakse nii bio-, kemo-, kui ka fotoluminenstseeruvaid ühendeid • Probleemiks on tihti fooni fluorestseerumine, millest on võimalik üle saada kasutades pika elueaga fluorofoore ja nn ajas lahutatud mõõtmismetoodikat • Ajas lahutatud fluorestsents: süsteemi, mis sisaldab pika elueaga fluorestseeruvat markerit ergastatakse laseri nanoimpulsiga. Fooni intensiivsus langeb 10 ns jooksul, pärast seda on võimalik mõõta markeri signaali, mis kestab 100 ns

39. Immunotesti komponendid Immuno-analüütilised meetodid Standardmaterjalid • Kvantiseerimise täpsus immunotestis sõltub sellest, kui täpselt on valitud standardi maatriksi koostis võrreldes proovi maatrikiga (seerum, sülg, uriin) kusjuures standardi koostis peaks võimalikult sarnanema proovile • Antigeeni kvantiseerimine proovis toimub selle ja standardlahuste reaktsioonide võrdlemise teel

40. Põhimõte Näide vaba fraktsiooni adsorbeerimine aktiivsüsi seotud fraktsiooni sadestamine etanool, ammonium sulfaat tahke faasi kasutamine antikehad on kovalentselt seotud toru seintele, plaadile magnetosakesed Immuno-analüütilised meetodid Immunotesti komponendid Seotud Ag eraldamine vabast Ag-st • Immunotesti edu sõltub sellest, kui edukalt on võimalik lahutada seotud fraktsioon vabast fraktsioonist • Kasutatakse adsorbente (aktiveeritud süsi, dekstraan) või sadestamist, antikehade sidumist plastikust plaatide pinnale • Kasutatakse teisi spetsiifilise sidumise omadusi spetsiifiline sidumine Proteiin –A avidiin-biotiin

41. Immunoekstraktsioon: üliselektiivne proovi ettevalmistamise meetod Immuno-analüütilised meetodid • Polüklonaased Ab-d on kasutusel ainete klassi eraldamiseks, monoklonaalsed Ab- selekteerivad ühe aine • Padrun on täidetud sorbendiga, millele on immobiliseeritud antikehad (kovalentselt või adsorbeerituna) • Protseduur: proovi voolutamine, padruni pesemine ja elueerimine • Ag elueeritakse metanooli, etanooli või atsetonitriiliga