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Multiples Sequenz Alignment

Literatur: Kapitel 4 in Buch von David Mount Thioredoxin-Beispiel heute aus Buch von Arthur Lesk. Multiples Sequenz Alignment. Alignments können einfach oder schwer sein. GCGGCCCA TCAGGTACTT GGTGG GCGGCCCA TCAGGTAGTT GGTGG GCGTTCCA TCAGCTGGTT GGTGG GCGTCCCA TCAGCTAGTT GGTGG

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  1. Literatur: Kapitel 4 in Buch von David Mount Thioredoxin-Beispiel heute aus Buch von Arthur Lesk Multiples Sequenz Alignment Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  2. Alignments können einfach oder schwer sein GCGGCCCA TCAGGTACTT GGTGG GCGGCCCA TCAGGTAGTT GGTGG GCGTTCCA TCAGCTGGTT GGTGG GCGTCCCA TCAGCTAGTT GGTGG GCGGCGCA TTAGCTAGTT GGTGA ******** ********** ***** TTGACATG CCGGGG---A AACCG TTGACATG CCGGTG--GT AAGCC TTGACATG -CTAGG---A ACGCG TTGACATG -CTAGGGAAC ACGCG TTGACATC -CTCTG---A ACGCG ******** ?????????? ***** Einfach Schwierig wegen Insertionen und Deletionen (indels) Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  3. Protein-Alignment kann durch tertiäre Strukturinformationen geführt werden Escherichia coli DjlA protein Homo sapiens DjlA protein nur so kann man letztlich auch bewertet, ob ein Sequenzalignment korrekt ist. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  4. Definition von “Homologie” • Homologie: Ähnlichkeit, die durch Abstammung von einem gemeinsamen Ursprungsgen herrührt – die Identifizierung und Analyse von Homologien ist eine zentrale Aufgabe der Phylogenie. • Ein Alignment ist eine Hypothese für die positionelle Homologie zwischen Basenpaaren bzw. Aminosäuren. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik http://www.cellsignal.com

  5. MSA für Thioredoxin-Familie Farbe Aminosäuretyp Aminosäuren gelb klein, unpolar Gly, Ala, Ser, Thr grün hydrophob Cys, Val, Ile, Leu Pro, Phe, Tyr, Met, Trp violett polar Asn, Gln, His rot negativ geladen Asp, Glu blau positiv geladen Lys, Arg Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  6. Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie Thioredoxin: aus 5 beta-Strängen bestehendes beta-Faltblatt, das auf beiden Seiten von alpha-Helices flankiert ist. gemeinsamer Mechanismus: Reduktion von Disulfidbrücken in Proteinen Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  7. Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie 1) am stärksten konservierte Abschnitte entsprechen wahrscheinlich dem aktiven Zentrum. Disulfidbrücke zwischen Cys32 und Cys35 gehört zu konserviertem WCGPC[K oder R] Motiv Andere konservierte Sequenzabschnitte, z.B. Pro76Thr77 und Gly92Gly93 sind an der Substratbindung beteiligt. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  8. Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie 2) Abschnitte mit vielen Insertionen und Deletionen entsprechen vermutlich Schleifen an der Oberfläche. Eine Position mit einem konservierten Gly oder Pro läßt auf eine Wendung der Kette (‚turn‘) schließen. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  9. Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie 3) Ein konserviertes Muster hydrophober Bausteine mit dem Abstand 2 (d.h., an jeder zweiten Position), bei dem die dazwischenliegenden Bausteine vielfältiger sind und auch hydrophil sein können, läßt auf ein -Faltblatt an der Moleküloberfläche schließen. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  10. Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie 4) Ein konserviertes Muster hydrophober Aminosäurereste mit dem Abstand von ungefähr 4 läßt auf eine -Helix schließen. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  11. Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie Die Thioredoxine sind Teil einer Superfamilie, zu der auch viele weiter entfernte homologe Protein gehören, z.B. Glutaredoxin (Wasserstoffdonor für die Reduktion von Ribonukleotiden bei der DNA-Synthese) Protein-Disulfidisomerase (katalysiert bei der Proteinfaltung den Austausch falsch gefalteter Disulfidbrücken) Phosducin (Regulator in G-Protein-abhängigen Signalübertragungswegen) Glutathion-S-Transferasen (Proteine der chemischen Abwehr). Die Tabelle des MSAs für Thioredoxinsequenzen enthält implizit auch Muster, die man zur Identifizierung dieser entfernteren Verwandten nutzen kann. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  12. Multiples Sequenz-Alignment- Methoden Es gibt im wesentlichen 3 unterschiedliche Vorgehensweisen: (1) Manuell (2) Automatisch (3) Kombiniert Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  13. Gründe für manuelles Alignment manuelles Alignment bietet sich an falls • Alignment einfach ist. • es zusätzliche (strukturelle) Information gibt. • automatische Alignment –Methoden in lokalen Minima feststecken. • ein automatisch erzeugtes Alignment manuell “verbessert” werden kann. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  14. multiples Sequenzalignment 2 Methoden: • DynamischeProgrammierung • betrache 2 Proteinsequenzen von 100 Aminosäuren Länge. • wenn es 1002Sekunden dauert, diese beiden Sequenzen erschöpfend zu alignieren, dann wird es 1003Sekunden dauern um 3 Sequenzen zu alignieren, 1004Sekunden für 4 sequences und 1.90258x1034Jahre für 20 Sequenzen. • Progressives Alignment Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  15. dynamische Programmierung mit MSA Programm berechne zunächst paarweise Alignments für 3 Sequenzen wird Würfel aufgespannt: D.h. dynamische Programmierung hat nun Komplexität n1 * n2 * n3 mit den Sequenzlängen n1, n2, n3. Sehr aufwändig! Versuche, Suchraum einzuschränken. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  16. dynamische Programmierung mit MSA Programm Links: Baum für 5 Sequenzen ohne Paarung von Sequenzen. Neighbour-joining Methode: berechne Summe aller Kantenlängen S = a + b + c + d + e (Kantenlängen sind bekannt) In diesem Fall seien sich A und B am nächsten. Konstruiere daher den Baum rechts. Generell: Verbinde die Sequenzpaare mit den kürzesten Abständen …  Man erhält den Baum mit der kleinsten Summe der Kantenlängen. Konstruiere anhand phylogenetischem Baum ein versuchsweises Multiples Sequenz Alignment. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  17. dynamische Programmierung mit MSA Programm Dieses Alignment dient dazu, den möglichen Raum inmitten des Würfels einzugrenzen, in dem das beste MSA zu finden sein sollte. Grosse Rechenersparnis! Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  18. Progressives Alignment • wurde von Feng & Doolittle 1987 vorgestellt • ist eigentlich eine heuristische Methode. Daher ist nicht garantiert, das “optimale” Alignment zu finden. • benötigt(n-1) + (n-2) + (n-3) ... (n-n+1)paarweise Sequenzalignments als Ausgangspunkt. • weitverbreitete Implementation in Clustal (Des Higgins) ClustalW ist eine neuere Version, in der den Parameter für Sequenzen und Programm Gewichte (weights) zugeteilt werden. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  19. Überblick der ClustalW Prozedur Hbb_Human 1 - CLUSTAL W Hbb_Horse 2 .17 - Hba_Human 3 .59 .60 - Hba_Horse 4 .59 .59 .13 - Schnelle paarweise Alignments: berechne Matrix der Abstände Myg_Whale 5 .77 .77 .75 .75 - Hbb_Human 4 2 3 Hbb_Horse Hba_Human 1 Nachbar-Verbindungs- Baumdiagramm Hba_Horse Myg_Whale alpha-helices 1 PEEKSAVTALWGKVN--VDEVGG 2 3 4 2 GEEKAAVLALWDKVN--EEEVGG progressive Alignments entsprechend dem Baumdiagramm 3 PADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGA 1 4 AADKTNVKAAWSKVGGHAGEYGA 5 EHEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQ Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  20. ClustalW- Paarweise Alignments • Berechne alle möglichen paarweisen Alignments von Sequenzpaaren. Es gibt (n-1)+(n-2)...(n-n+1) Möglichkeiten. • Berechne aus diesen isolierten paarweisen Alignments den “Abstand” zwischen jedem Sequenzpaar. • Erstelle eine Abstandsmatrix. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  21. Clustal W - Nachbarschaftsbaum • aus den paarweisen Distanzen wird ein Nachbarschafts-Baum erstellt • Dieser Baum gibt die Reihenfolge an, in der das progressive Alignment ausgeführt werden wird. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  22. Multiples Alignment- Erstes Paar • aligniere die beiden ähnlichsten Sequenzen zuerst. • dieses Alignment ist dann “fest” und wird nicht mehr angetastet. Falls später ein GAP eingeführt werden muss, wird er in beiden Sequenzen an der gleichen Stelle eingeführt. • Deren relatives Alignment bleibt unverändert. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  23. Clustal W – Zeit der Entscheidung Ziehe den Baum heran um festzulegen, welches Alignment als nächstes durchgeführt werden soll: • aligniere eine dritte Sequenz zu den ersten beiden oder • aligniere zwei total verschiedene Sequenzen miteinander. Option 1 Option 2 Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  24. ClustalW- Alternative 1 Wenn beim Alignment einer dritten Sequenz mit den ersten beiden eine Lücke eingefügt werden muss um das Alignment zu verbessern, werden beide als Einzelsequenzen betrachtet. + Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  25. ClustalW- Alternative 2 Falls, andererseits, zwei getrennte Sequenzen aligniertwerden müssen, werden diese zunächst miteinander aligniert. + Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  26. Progressives Alignment – 1. Schritt gctcgatacgatacgatgactagcta gctcgatacaagacgatgacagcta gctcgatacacgatgactagcta gctcgatacacgatgacgagcga ctcgaacgatacgatgactagct gctcgatacgatacgatgactagcta gctcgatacaagacgatgac-agcta Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  27. Progressives Alignment – 2. Schritt gctcgatacgatacgatgactagcta gctcgatacaagacgatgacagcta gctcgatacacgatgactagcta gctcgatacacgatgacgagcga ctcgaacgatacgatgactagct gctcgatacacgatgactagcta gctcgatacacgatgacgagcga Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  28. Progressives Alignment – 3. Schritt gctcgatacgatacgatgactagcta gctcgatacaagacgatgac-agcta + gctcgatacacgatgactagcta gctcgatacacgatgacgagcga gctcgatacgatacgatgactagcta gctcgatacaagacgatgac-agcta Gctcgatacacga---tgactagcta Gctcgatacacga---tgacgagcga Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  29. Progressives Alignment – letzter Schritt gctcgatacgatacgatgactagcta gctcgatacaagacgatgac-agcta gctcgatacacga---tgactagcta gctcgatacacga---tgacgagcga + ctcgaacgatacgatgactagct gctcgatacgatacgatgactagcta Gctcgatacaagacgatgac-agcta gctcgatacacga---tgactagcta gctcgatacacga---tgacgagcga -ctcga-acgatacgatgactagct- Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  30. ClustalW- Vor- und Nachteile Vorteil: • Geschwindigkeit. Nachteile: • keine objektive Funktion. • Keine Möglichkeit zu quantifizieren ob Alignment gut oder schlecht ist. • Keine Möglichkeit festzustellen, ob das Alignment “korrekt” ist. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  31. ClustalW-Lokales Minimum Mögliche Probleme: • in ein lokales Minimum zu geraten. Falls zu einem frühen Zeitpunkt ein Fehler im Alignment eingebaut wird, kann dieser später nicht mehr korrigiert werden. • ZufälligesAlignment. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  32. Genauigkeit des Alignments verbessern • Sollen all Sequenzen gleich behandelt werden? Obwohl manche Sequenzen eng verwandt und andere entfernt verwandt sind? • Sollen alle Positionen der Sequenzen gleich behandelt werden? Obwohl sie unterschiedliche Funktionen und Positionen in der dreidimensionalen Strukturen haben können? Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  33. ClustalW- Besonderheiten • Sequenzgewichtung • Variable Substitutionsmatrizen • Residuen-spezifische Gap-Penalties und verringerte Penalties in hydrophilen Regionen (externe Regionen von Proteinsequenzen), bevorzugt Gaps in Loops anstatt im Proteinkern. • Positionen in frühen Alignments, an denen Gaps geöffnet wurden, erhalten lokal reduzierte Gap Penalties um in späteren Alignments Gaps an den gleichen Stellen zu bevorzugen Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  34. ClustalW- vom Benutzer festzulegende Parameter • Zwei Parameter sind festzulegen (es gibt Default-Werte, aber man sollte sich bewusst sein, dass diese abgeändert werden können): • Die GOP- Gap Opening Penaltyist aufzubringen um eine Lücke in einem Alignment zu erzeugen • Die GEP- Gap Extension Penaltyist aufzubringen um diese Lücke um eine Position zu verlängern. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  35. Positions-spezifische Gap penalties • Bevor irgendein Sequenzpaar aligniert wird, wird eine Tabelle von GOPs erstellt für jede Position der beiden Sequenzen. • Die GOP werden positions-spezifisch behandelt und können über die Sequenzlänge variieren. • Falls ein GAP an einer Position existiert, werden die GOP und GEP penalties herabgesetzt – und alle anderen Regeln treffen nicht zu. • Daher wird die Bildung von Gaps an Positionen wahrscheinlicher, an denen bereits Gaps existieren. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  36. Vermeide zu viele Gaps • Solange kein GAP offen ist, wird GOP hochgesetzt falls die Position innerhalb von 8 Residuen von einem bestehenden Gap liegt. • Dadurch werden Gaps vermieden, die zu eng beieinander liegen. • An jeder Position innerhalb einer Reihe von hydrophilen Residuen wird GOP herabgesetzt, da diese gewöhnlich in Loop-Regionen von Proteinstrukturen liegen. • Eine Reihe von 5 hydrophilen Residuen gilt als hydrophiler stretch. • Die üblichen hydrophilen Residuen sind: D Asp K Lys P Pro E Glu N Asn R Arg G Gly Q Gln S Ser Dies kann durch den Benutzer geändert werden. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  37. Divergente Sequenzen • Die am meisten divergenten Sequenzen (also am stärksten von allen anderen Sequenzen verschiedenen) sind gewönlich am schwierigsten zu alignieren • Es ist manchmal besser, ihr Alignment auf einen späteren Zeitpunkt zu verschieben (nachdem die einfacheren Sequenzen aligniert wurden) • Man kann dazu einen Cutoff wählen (der Default liegt bei 40% Identität). Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  38. Tips für progressives Alignment • Progressives Alignment ist ein mathematischer Vorgang, der völlig unabhängig von der biologischen Realität abläuft. • Es kann eine sehr gute Abschätzung sein. • Es kann eine unglaublich schlechte Abschätzung sein. • Erfordert Input und Erfahrung des Benutzers. • Sollte mit Vorsicht verwendet werden. • Kann (gewöhnlich) manuell verbessert werden. • Es hilft oft, farbliche Darstellungen zu wählen. • Je nach Einsatzgebiet sollte der Benutzer in der Lage sein, die zuverlässigen Regionen des Alignments zu beurteilen. • Für phylogenetische Rekonstruktionen sollte man nur die Positionen verwenden, für die eine zweifelsfreie Hypothese über positionelle Homologie vorliegt. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  39. Alignment von Protein-kodierenden DNS-Sequenzen • Es macht wenig Sinn, proteinkodierende DNS-Abschnitte zu alignieren! ATGCTGTTAGGG ATGCTCGTAGGG ATGCT-GTTAGGG ATGCTCGT-AGGG Das Ergebnis kann sehr unplausibel sein und entspricht eventuell nicht dem biologischen Prozess. Es ist viel sinnvoller, die Sequenzen in die entsprechenden Proteinsequenzen zu übersetzen, diese zu alignieren und dann in den DNS-Sequenzen an den Stellen Gaps einzufügen, an denen sie im Aminosäure-Alignment zu finden sind. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  40. Software für manuelle Alignments GDE- The Genetic Data Environment (UNIX) CINEMA- Java applet available from: • http://www.biochem.ucl.ac.uk Seqapp/Seqpup- Mac/PC/UNIX available from: • http://iubio.bio.indiana.edu SeAl for Macintosh, available from: • http://evolve.zoo.ox.ac.uk/Se-Al/Se-Al.html BioEdit for PC, available from: • http://www.mbio.ncsu.edu/RNaseP/info/programs/BIOEDIT/bioedit.html Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  41. Beispiel: Src-Kinase HcK Sequenz: MGGRSSCEDP GCPRDEERAP RMGCMKSKFL QVGGNTFSKT ETSASPHCPV YVPDPTSTIK PGPNSHNSNT PGIREAGSED IIVVALYDYE AIHHEDLSFQ KGDQMVVLEE SGEWWKARSL ATRKEGYIPS NYVARVDSLE TEEWFFKGIS RKDAERQLLA PGNMLGSFMI RDSETTKGSY SLSVRDYDPR QGDTVKHYKI RTLDNGGFYI SPRSTFSTLQ ELVDHYKKGN DGLCQKLSVP CMSSKPQKPW EKDAWEIPRE SLKLEKKLGA GQFGEVWMAT YNKHTKVAVK TMKPGSMSVE AFLAEANVMK TLQHDKLVKL HAVVTKEPIY IITEFMAKGS LLDFLKSDEG SKQPLPKLID FSAQIAEGMA FIEQRNYIHR DLRAANILVS ASLVCKIADF GLARVIEDNE YTAREGAKFP IKWTAPEAIN FGSFTIKSDV WSFGILLMEI VTYGRIPYPG MSNPEVIRAL ERGYRMPRPE NCPEELYNIM MRCWKNRPEE RPTFEYIQSV LDDFYTATES QYQQQP SMART ergibt: Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  42. Beispiel: Src-Kinase HcK Kinase-Einheit Protein Data Bank http://www.rcsb.org 1ATP Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  43. Beispiel: Src-Kinase HcK SH3 Domäne Src homology 3 (SH3) Domänen binden an Zielproteine mit Sequenzen, die Proline und hydrophobe Aminosäuren enthalten. Pro-enthaltende Polypeptide können an SH3 in zwei verschiedenen Orientierungen binden. SH3 Domänen sind kleine Proteinmodule von ungefähr 50 Residuen Länge. Man findet sie in vielen intrazellulären oder Membran-assoziierten Proteinen … CATH: 1abo Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  44. Beispiel: Src-Kinase HcK SH2 Domäne Die Src homology 2 (SH2) Domäne ist eine Proteindomäne mit etwa 100 Aminosäuren. SH2 Domänen funktionieren als Regelmodule von intrazellulären Signalkaskaden indem sie mit grosser Affinität an Phospho-Tyrosin enthaltende Peptide binden. SH2 Domänen findet man oft zusammen mit SH3 Domänen … Ihre Struktur ist alpha+beta … CATH: 1g83 1fbz 1aot Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  45. Beispiel: Src-Kinase HcK http://jkweb.berkeley.edu/ Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  46. Was kann man mit modularem Denken erreichen? http://www.cellsignal.com Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  47. Zusammenfasusng Progressive Alignments sind die am weitesten verbreitete Methode für multiple Sequenzalignments. Sehr sensitive Methode ebenfalls: Hidden Markov Modelle (HMMer) Multiples Sequenzalignment ist nicht trivial. Manuelle Nacharbeit kann in Einzelfällen das Alignment verbessern. Multiples Sequenzalignment erlaubt Denken in Proteinfamilien und –funktionen. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

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