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Chemical compounds in differentiation and death of stem cells

Chemical compounds in differentiation and death of stem cells. Celia Conesa Montanel. Introducción. Developmental Potential. Pluripotent. Totipotent. Multipotent. Unipotent. Firestone y Chen ACS Chemical Biology, 2010, 5:15-34. Introducción.

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Chemical compounds in differentiation and death of stem cells

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Presentation Transcript

  1. Chemical compounds in differentiation and death of stem cells Celia Conesa Montanel

  2. Introducción Developmental Potential Pluripotent Totipotent Multipotent Unipotent Firestone y Chen ACS Chemical Biology, 2010, 5:15-34

  3. Introducción Compuestos químicos que modifican la actividad proteica directa (cambios fenotípicos) reversa (cambios en proteína, y luego efecto fenotípico) Genética Química Firestone y Chen ACS Chemical Biology, 2010, 5:15-34

  4. Introducción Genética Química • DIFERECIACIÓN CELULAR: • Tipos celulares específicos • DESDIFERENCIACIÓN CELULAR: • iPS • TOXICIDAD SELECTIVA: • Control de carcinomas • Selección SC Firestone y Chen ACS Chemical Biology, 2010, 5:15-34

  5. Introducción Muerte celular • Tejidos: proliferación celular muerte celular • Tipos: APOPTOSIS Desarrollo y Morfogénesis Procesos fisiológicos Eliminación selectiva NECROSIS http://www.anatomiahumana.ucv.cl/biologia

  6. Extrínseca Intrínseca

  7. Hipótesis En colecciones complejas de compuestos químicos hay compuestos capaces de activar o inhibir: • diversas proteínas que participan en la proliferación y diferenciación de células madre • rutas apoptóticas de forma selectiva en células madre o células diferenciadas

  8. Objetivos • Identificar compuestos químicos que induzcan diferenciación celulara cardiomiocitos a partir de células madre embrionarias de ratón • Identificar compuestos químicos que induzcan muerte celular programada durante la proliferación y diferenciación de estas células.

  9. Línea celular: mES CGR8-AMPIGX-7 • AMPIGX-7: GFP bajo el control de la cadena pesada de la miosina alfa (-MHC). • Dr. Agapios Sachinidis (Universidad de Colonia, Alemania) • Requerimientos de cultivo: • Células indiferenciadas • Sin células “feeder” • Medio de cultivo con LIF • Diferenciación cardiomiocitos • Medio de cultivo sin LIF • Cuerpos embrioides • Gota colgante (“Hanging drop”) • Suspensión

  10. Medio cultivo Células Línea celular: mES CGR8-AMPIGX-7 • Diferenciación: EB • Nuevo método: placas de 96 pocillos, fondo V 500 células/EB

  11. Línea celular: mES CGR8-AMPIGX-7 Diferenciación: EB Nuevo método: placas de 96 pocillos, fondo V PROBLEMA • Cantidad de GFP insuficiente para ser detectada en lector de placas • Un solo ensayo de actividad por experimento

  12. A partir de la línea original mES CGR8 Nuevo gen reportador: LUCIFERASA (-MHC) Metridia Gaussia Dos nuevas líneas celulares Actividad Luciferasa secretada Sobrenadante

  13. Dos nuevas líneas celulares Amplificación DNA purificación Linerización del DNA mES CGR8 4x107 células/ml de PBS Extracción DNA Fenol-Cloroformo ELECTROPORACIÓN medio de propagación placas de 10 cm Medio de selección: Geneticina (G-418) a 0,5 mg/ml

  14. Clones aislados: Cilindros de clonación Lavado con PBS Colocación del cilindro (presión) Tripsina (20-50 l) Placa de 96 pocillos Placa de 24 pocillos Placa de 6 pocillos Frascos de 25 cm2: Placa de 6 pocillos, pellet -80ºC Selección de clones 30 clones de cada 7 clones Metridia

  15. Selección de clones Clones que contienen: promotor decardiomiocitos + luciferasa PCR Southern blot Selección funcional (expresión de luciferasa)

  16. Selección de clones - Expresión luciferasa Siembra en placas 96 fondo V, en medio de diferenciación: 500 células/EB 2000 células/EB Incubación: 8-10 días (Diferenciación) Ensayo de luciferasa 25 l medio de cultivo + 2,5 l sustrato luciferasa Medida de luminiscencia

  17. Selección de clones - Expresión luciferasa RLU

  18. Selección de clones - Expresión luciferasa • Respuesta a compuestos químicos (10 M): • Diferenciadores: Verapamil • Inhibidores: Forskolin • 500 células/EB • Compuestos tras 2 días de formación del EB

  19. Selección de clones - Southern blot • Sonda: • Digestión cDNA de MetLuc con SmaI: Luciferasa • 333 pb • Digestión DNA genómico: • HindIII + NotI: promotor+luciferasa • Al menos 6197 pb MWM CGR8 M1 M5 M6 M14

  20. Objetivos • Identificar compuestos químicos que induzcan diferenciación celulara cardiomiocitos a partir de células madre embrionarias de ratón • Identificar compuestos químicos que induzcan muerte celular programada durante la proliferación y diferenciación de estas células.

  21. CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular Quimioteca 2 l/100 l medio mES CGR8 (10,000 células/pocillo) 48h incubación 4 ó 3 compuestos/pocillo (10 M) C-: DMSO C+: CPT (10 M) Placa intermedia 4 ó 3 compuestos/pocillo (500 M) C-: DMSO C+: Camptothecin (CPT) (500 M) Compuestos a5 mM Ensayo colorimétrico de viabilidad XTT proliferation kit Medida de la absorbancia a 450 nm XTT (2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) Formazan

  22. CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular % Viabilidad • Grupos de compuestos donde disminuyó la viabilidad, se seleccionaron para probarlos individualmente: • mouse embryonic stem cells CGR8 (mES CGR8) (10,000 cells/well) • mouse embryonic fibroblasts (MEFs) (2,500 cells/well)

  23. CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular % Viabilidad % Viabilidad

  24. CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular COMPUESTOS CON ACTIVIDAD DIFERENCIAL A 10 M % Viabilidad

  25. CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular TINCIÓN VITAL CON AZUL TRYPAN % Viabilidad

  26. Estudio de la muerte celular • Bax/Bak Double Knockout MEFs (DKO-MEFs) • Inhibidor de caspasas: z-VAD-fmk z-VAD-fmk 100 M 30 min antes que los compuestos DKO-MEFs, mES CGR8 o MEFs Compuestos a 10 M 48 h Ensayo de XTT

  27. Estudio de la muerte celular

  28. Estudio de muerte celular Vía intrínseca Caspasa-9 Vía extrínseca Caspasa-8 • Actividad de Caspasa-3 • MEFs + 26D • ESCs + 119A y 223A Caspasa-3 Compuestos a 10 M durante 12 h mES CGR8 o MEFs Lisis celular y ensayo colorimétrico para detectar la hidrólisis de acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA) (200 M) por la Caspasa-3 Absorbancia a 405 nm a 0, 30 min, 1h, 2h y 4 h

  29. Estudio de muerte celular • Actividad de Caspasa-3 • MEFs + 26D • ESCs + 119A y 223A Abs 405 nm

  30. Estudio de muerte celular • Inhibición de caspasas en el tiempo • Incubación con los compuestos: 3, 6, 12, 24 y 48h ESCs MEFs Sin z-VAD-fmk Con z-VAD-fmk % Viabilidad % Viabilidad % Viabilidad % Viabilidad

  31. Estudio de muerte celular • MICROSCOPÍA- Núcleos apoptóticos mES CGR8 (150.000 células/pocillo) MEFs (25.000 células/pocillo) Compuestos a 10 M durante 24 h Hoechst 33342 (1 g/ml) durante15 min Microscopio de fluorescencia

  32. ESCs MEFs DMSO 26D 223A

  33. Ensayos de dosis-respueta Concentraciones: 0,1-100 M (Ensayo XTT) % Viabilidad LD50 ~ 40 M LD50 ~ 7 M LD50 ~ 8 M % Viabilidad LD50 ~ 20 M LD50 ~ 25 M

  34. Ensayos de dosis-respueta 223A % Viability iPS cells and human fibroblasts Doss M.X., Antzelevitch C., (Nueva York, USA) 26D % Viability

  35. CRIBADO QUIMIOTECA Se han identificado compuestos que inducen apoptosis selectivamente en SCs Uso: Eliminar células indiferenciadas y prevenir la formación de teratomas Se ha identificado un compuesto que induce apoptosis selectivamente en MEFs Uso: Aislamiento de células madre en tejidos Estos compuestos pueden usarse como herramienta para estudiar diferencias en las rutas apoptóticas entre SCs y somáticas CONCLUSIONES

  36. Ensayos en ratones Ratones (Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu/un (Harlan)) CGR8: 500.000 células Compuesto 223A Grupos experimentales: 1: Control (sin tratar) 2: Tratamiento pre-inducción 3: Tratamiento post-inducción

  37. Proliferación celular % Viabilidad

  38. Proliferación celular BrdU ELISA XTT % Viabilidad % Viabilidad

  39. Planes para el futuro • Cribado de otras quimiotecas • Proliferación celular (muerte y metabolismo) • Diferenciación celular • Mecanismos de acción • Células madre humanas: • hESC (ES4) • hiPS ([K]iPS4F-1)

  40. Agradecimientos José Alberto Carrodeguas Javier Sancho Verónica Tomey Colaboradores externos: Michael Xavier Doss Charles Antzelevitch Agapios Sachinidis Stem Cell Center, Masonic Medical Research Laboratory Utica, New York, USA University of Cologne, Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology Cologne. Alemania

  41. ¡Muchas gracias!

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