Dvojrozměrná (2D) elektroforéza proteinů Umožňuje rozlišení až 10 000 proteinů.

1. Dvojrozměrná (2D) elektroforéza proteinů • Umožňuje rozlišení až 10 000 proteinů. • Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich izoelektrického bodu v gradientu pH. • Po separaci v prvním rozměru je provedena běžná elektroforéza v gelu. • Proteiny migrují ve druhém rozměru v závislosti na své velikosti.

2. Výsledné „mapy“ proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po „vyříznutí“ oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza hmotnostní spektrometrií.

3. Interakce mezi antigenem a protilátkou • Smícháme-li roztok antigenu s roztokem protilátky v přesném stechiometrickém poměr vzniká precipitát (sraženina). • Studiem této interakce je možné zjistit údaje o: • Obsahu protilátky • efektivním počtu vazebních míst v molekule antigenu • Stabilitu vznikých imunokomplexů určují mezimolekulové síly. Tj. Jde o stejné síly, které se podílejí na stabilizaci prostorové struktury proteinů a jiných makromolekul: • vodíkové vazby, • hydrofóbní interakce, • elektrostatické síly, • disperzní síly, • prostorové odpudivé síly

4. Klasická precipitační reakce Při interakce antigenu s protilátkou dochází k podobné situaci, jako při srážecích reakcích. Budeme-li přidávat antigen k určitém množství protilátky, bude nejdříve postupně docházet k narůstající tvorbě precipitátu (tj. Tvorbě komplexu antigen-protilátka). Přidáváním antigenu se po určité době dosáhne optima, za kterým vzniká méně precipitátu. V této fázi reakce už vznikají rozpustné komplexy antigenu a protilátky. Antigen ani protilátka nejsou přítomny v supernatantu mprecipitát Ekvivalentní bod mantigenu

5. Z precipitační křivky lze vidět, že přidáváním stále většího množství antigenu se dosáhne určité optimum, za kterým vzniká už méně precipitátu. Analýzou precipitátu vytvořeného při nadbytku protilátky, kdy se vazebné místa na antigenu dostatečně nasytí, lze určit molární poměr antigenu a protilátky v komlexu a tedy i vaznost antigenu.

6. Schéma imunoelektroforézy Imunoelektroforéza je využívána pro analýzu komplexních směsí proteinů s využitím odpovídajícíh imunosér a k identifikaci proteinů na základě jejich elektroforetické pohyblivosti a antigenicity.

7. Protisměrná imunoelektroforéza Protisměrné imunoelektroforéza (electrosynersis, counter-imunoelectrophoresis) je imunoelektroforetická technika využívající migrace antigenu i protilátky ve stejnosměrném elektrickém poli v agarovém gelu. • Do agarového gelu se vyříznou dvě jamky na proti sobě v určité vzdálenosti. • Do jedné se nadávkuje antigen a do druhé protilátka. • Při protisměrné imunoelektroforéze se využívá elektroosmotického toku, který má za následek pohyb kapaliny v gelu od anody ke katodě. • Pracuje se při hodnotě pH, kdy protilátka nemá žádný elektrický náboj a pohybuje se stejným směrem a stejně rychle jako elektroosmotický tok. Protilátka se dávkuje do jamky blízké anodě a antigen naopak do jamky blízké katodě.

8. Takto to je zajištěná protisměrná migrace antigenu a protilátky. V místě kde se antigen a protilátka setkají v poměru koncentrací odpovídajích zóně ekvivalence vznikne precipitační linie. Protisměrná imunoelektroforéza probíhá velmi rychle (většinou během 10 minut) a jedná se o velmi citlivé gelovou imunoprecipitační techniku. Křížová imunoelektroforéza (CRIE) Křížová imunoelektroforéza (dvoudimenziální imunoelektroforéza) je modifikací immunoelektroforézy. Antigeny jsou v prvním kroce separovány v agarovém nebo agarosovém gelu podle své elektroforetické pohyblivosti. Ve druhém kroku je opět využito elektrofézy (dotud dvoudimenzionální imunoelektroforéza). Rozseparováné antigeny se nechají migrovat do gelu obsahující protilátku specifickou pro antigen, který chceme detekovat. CRIE je mnohem citlivější technika oproti IEP a navíc poskytuje větši rozlišení.

9. Elektroferogram CRIE

10. Raketová imunoelektroforéza Raketová imunoelektroforéza (elektroimunostanovení) je založená na migraci antigenu do gelu impregnovaného protilátkou. Využívá se opět agarosový gel impregnovaný protilátkou a pracuje se v prostředí o pH 8,6. Do jamek se nadávkuje roztok antigenu a nechá se migrovat do gelu obsahující protilátky. Při pH 8,6 protilátka v gelu téměř nemigruje nebo jen velmi pomalu a bez přítomnosti elektroosmotického toku. Naopak antigeny nesoucí elektrický náboj migrují do gelu (současně zde ale působí i příčná difúze) a při kontaktu s protilátkou vzniká precipitát, který se projeví jako precipitační píky. Doba elektroforézy se podle použitého napětí pohybuje nejčastěji mezi 6 až 16 hodinami. Plocha a výška precipitačních píků je úměrná koncentraci antigenu, který byl dávkován do jednotlivých jamek. Raketová imunoelektroforéza se využívá k citlivým stanovením. Pracuje se metodou kalibrační křivky, která je ale lineární pouze ve velmi úzkém intervalu a vzorek je tedy nutné zředit nebo zakoncentrovat podle rozhsahu linární kalibrační křivky.

11. Imunofixace Imunofixace zahrnuje elektroforetické dělení proteinů s následnou imunoprecipitací za použití specifických antisér. Imunofixace je imunoelektroforetická metoda, která slouží k detekci rozseparovaných proteinů elektroforézou na agarosovém gelu nebo v gelu na bázi acetátu celulózy. K detekci rozseparovaných bílkovin v následném kroku po separaci pak slouží imunoprecipitační reakce. Do gelu se vyříznou jamky a do nich se nadávkují vzorky obsahující antigeny, které chceme detekovat a stanovit a provede se elektroforetická separace antigenů.

12. Po ukončení elekroforetické separace se na gel přiloží šablona, která má vyříznuté proužky odpovídající dráze migrace jednotlivých vzorků gelem (podobně jako závodní běžecké dráhy). • Do proužků se nanášejí specifické protilátky (např. proti imunoglobulinům), které difundují do gelu a v místech, kde se setkají s antigeny vytvoří precipitáty. • Po ukončení precipitačních reakcí se gel promyje vhodným pufrem, který vymyje nereagující antigeny s aplikovanými protilátkami a nadbytek protilátek. V gelu tedy zůstanou fixovány pouze precipitáty, jejiž zóny se zvýrazní obarvením. Při imunofixaci je velmi důležité ředění vzorku. Při nadbytku antigenu nebo protilátky se imunokomplex začne rozpadat, hrozí tedy při špatném naředění nemožnost průkazu nízkých koncentrací antigenu a vysokých koncentrací, které nespadají do zóny ekvivalence. Tento problém se řeší pomocí Western blottingu.

13. Použití zónové elektroforézy v klinické praxi Hypergamaglobulinemie Hypogamaglobulinemie Normální sérum