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Western blot 实验技术

Western blot 实验技术. 定义：. 印迹法（ blotting ）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975 年， Southern 建立了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜（ NC 膜）上，并利用 DNA － RNA 杂交检测特定的 DNA 片段的方法，称为 Southern 印迹法。 而后人们用类似的方法，对 RNA 和蛋白质进行印迹分析，对 RNA 的印迹分析称为 Northern 印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern 印迹法.

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Western blot 实验技术

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Presentation Transcript

  1. Western blot 实验技术

  2. 定义： • 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 • 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 • 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法

  3. Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

  4. Western Blot一般流程 • 蛋白样品的制备 • SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 • 转膜 • 封闭 • 一抗杂交 • 二抗杂交 • 底物显色

  5. 蛋白样品的制备 • 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 • 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 • 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 • 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白

  6. 蛋白样品的定量 Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量) 试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）

  7. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素

  8. 凝胶成份 • 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺  • SDS • 配胶的Tris缓冲液 • TEMED • 过硫酸铵(时间) • Tris-甘氨酸电泳缓冲液

  9. 凝胶浓度与蛋白分离范围

  10. 转膜 价格便宜 硝酸纤 维素膜 简单快速封闭非特异性抗体结合 膜的选择 封闭非特异性抗体结合麻烦 尼龙膜 价格昂贵 需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480µg/cm2；硝酸纤维素膜：80µg/cm2） 特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度

  11. 转膜 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。

  12. 转膜后检测 • 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次。 • 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。

  13. 封闭 • 脱脂奶粉（5％） • BSA • Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）

  14. 一抗、二抗孵育 • 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4 ℃过夜。 • 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 • 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。 • 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。

  15. 二抗与底物反应显色 • 辣根过氧化物酶法（HRP） • 碱性磷酸酶法（AP） • 化学发光显色法(HRP)

  16. Western Blot常见问题分析

  17. SDS-PAGE电泳 • 胶板洗刷干净 • 加入APS和TEMED的量要合适 • 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 • 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 • 两块玻璃板底部要对齐 • 胶不平？ • 凝胶漏液？

  18. 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 • 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 • 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 • 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 • 条带比正常的窄？ • “微笑”或“倒微笑”条带？

  19. 转膜及抗体检测 • 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min • 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 • 确保膜和胶块之间没有气泡 • 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 • 凝胶肿胀或卷曲？ • 条带歪斜或漂移？ • 单个或多个白点？ • 转膜缓冲液过热？

  20. 原因 • 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 • 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 • 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 • 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 • 膜没有均匀浸湿 • 膜或者缓冲液污染 • 封闭不充分 • 抗体与封闭剂出现交叉反应 • 抗体浓度过高 对 策 背景太高

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