Komplementārās DNS sintēze
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 18

Komplementārās DNS sintēze PowerPoint PPT Presentation


  • 222 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Komplementārās DNS sintēze. Agnese Ezerta (ae10021) . Kas ir komplementārā DNS?. Komplementārā DNS jeb kDNS - DNS, kas nes hromosomālajā DNS atrodamā gēna kodējošo secību. Atšķirībā no hromosomālās DNS :

Download Presentation

Komplementārās DNS sintēze

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Komplement r s dns sint ze

Komplementārās DNS sintēze

Agnese Ezerta (ae10021)


Komplement r s dns sint ze

Kas ir komplementārā DNS?

Komplementārā DNS jeb kDNS- DNS, kas nes hromosomālajā DNS atrodamā gēna kodējošo secību.

Atšķirībā no hromosomālāsDNS:

•nesatur nekodējošos rajonus (intronus); •iegūta ar sintēzes palīdzību, izmantojot mRNS virkni.

otrās ķēdes

kDNS sintēze

pirmās ķēdes


Komplement r s dns sint ze

Nedaudz vēstures...

◈ Reversā transkriptāze (RNS atkarīgā DNS polimerāze) – H. M. Temins un D. Baltimors 1970. gads.

Hovards M. Temins

Deivids Baltimors


Komplement r s dns sint ze

Komplementārās DNS pielietojums

• gēnu ekspresijas detektēšanai;

• eikariotisko gēnu klonēšanai prokariotos;

• kDNSbibliotēku veidošanai;

• kalpo kā pamats otrās ķēdes kDNS sintēzei.


Komplement r s dns sint ze

kDNS sintēzes pamatprincips

Wilson K, Walker K. 2010. PrinciplesandTechniquesofBiochemistryandMolecularBiology. 7th edition. Cambridge: CambridgeUniversityPress, 749 pp.


Komplement r s dns sint ze

Sintēzei izmantojamie reaģenti un to funkcija

• Reversā transkriptāze– veic kDNS sintēzi, gar RNS matricu pārvietojas 3’→5’ virzienā, sintezējot kDNS 5’→3’ virzienā.

• RNS praimeris– veido bāžu pārus ar RNS matricu, ierosina kDNS fragmenta sintēzi.

• Dezoksiribonukleotīdutrifosfāti (dNTP) – bāzes kDNS virknes veidošanai.

• Ribonukleāžu inhibitors – kDNS sintēzes laikā aizsargā RNS no degradēšanās.

•Reakcijas buferis ar MgCl2– sintēzes laikā nodrošina optimālo pH, enzīma specifiskumu substrātā un tā maksimālo aktivitāti.

• T4 DNS polimerāze I – katalizē DNS sintēzi 5’→3’ virzienā.

• RNāze H– degradē mRNS ķēdi.

• Reakcijas buferis DNS polimerāzei I – nodrošina DNS polimerāzes I darbību.


Komplement r s dns sint ze

Pirmās ķēdes kDNS sintēzē izmantojamo praimeru specifiskums

Wilson K, Walker K. 2010. PrinciplesandTechniquesofBiochemistryandMolecularBiology. 7th edition. Cambridge: CambridgeUniversityPress, 749 pp.


Komplement r s dns sint ze

Reaģentu izplatītāji


Komplement r s dns sint ze

Otrās ķēdes kDNS sintēzes veidi

1. Matadatas-Praimera sintēze;

http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/18267.pdf


Komplement r s dns sint ze

Otrās ķēdes kDNS sintēzes veidi

2. Okayama un Berga procedūra;

3. Gublera un Hoffmana procedūra.

http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/18267.pdf


Komplement r s dns sint ze

Izmantojamās ierīces

• Vortex (Centrifūga);

• Termostats;

⇢ Ierīce parauga sajaukšanai un nostādināšanai.

⇢ Ierīce nepieciešamas pastāvīgas temperatūras nodrošināšanai.


Komplement r s dns sint ze

Darba drošība

→ jāvelk halāts un gumijas cimdi;

→ darba virsma un mehāniskās pipetes jānotīra ar 75% etanolu;

→ pipešu uzgaļiem jābūt steriliem;

→ darbu var veikt boksā.


Komplement r s dns sint ze

Darba gaita – piemērs pirmās ķēdes kDNS sintēzei

  • Uz ledus sajauc

    • 500 ng RNS;

  • 1 µl 100 µMOligo(dT)18praimeri;

    • Ar DEPC apstrādātu ūdeni līdz 12,5 µl.

  • 2. Sajauc un inkubē 5 min +65ºC.

    3. Uz ledus atdzesē un paraugam pievieno

    4 µl 5X reakcijas buferi ar MgCl2;

    2 µl 10 mMdNTP maisījumu;

    0,5 µl 40 u/µlribonukleāžu inhibitoru;

    1 µl200 u/µl reverso transkriptāzi.

    4. Sajauc un inkubē 1 h +42ºC, pēc tam 10 min +70ºC.

    5. Paraugu uzglabā pie -20ºC.


    Komplement r s dns sint ze

    Piemērs ar rezultātiem– RT-PCR

    PCR produkti tika noteikti 3% agarozesgēla elektroforēzē.

    Gēna CD90 ekspresijas detektēšana ADSC

    Gēna β-aktīns ekspresijas detektēšana ADSC


    Komplement r s dns sint ze

    kDNS metodes +/-

    + vienkārši un ātri veicama;

    + iespējams iegādāties visus nepieciešamos reaģentos kopā (kits);

    + lēta;

    + nav nepieciešama dārga aparatūra.

    - jāstrādā ļoti uzmanīgi.


    Komplement r s dns sint ze

    Izmantotā literatūra

    • Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. 2002. Biochemistry. 5th edition. New York: W.H. Freeman and Company, 974 pp.

    • Collen S., Marks A.D., Lieberman M. 2007. Marks basic medical biochemistry. A clinical approach. 2nd edition. Baltimore: Lippincott Williams and Wilkins, 565 p.

    • Farrell R.E. 2010. RNA methodologies. A laboratory guide for isolation and characterization. 4th edition. London: Elsevier, 717 pp.

    • Herdewijn P. 2005. Methods in molecular biology. Vol.288. Oligonucleotide synthesis. Methods and Applications. Totowa: Human Press, 435 pp.

    • Metzler D.E. 2003. Biochemistry. The chemical reactions of living cell. 2nd edition. Vol.1 and 2. Portland: Elsevier, 1900 pp.

    • Mulhardt C. 2007. The experimental series. Molecular biology and genomic. California: Elsevier, 257 pp.

    • Wilson K, Walker K. 2010. PrinciplesandTechniquesofBiochemistryandMolecularBiology. 7th edition. Cambridge: CambridgeUniversityPress, 749 pp.


    Komplement r s dns sint ze

    Paldies par uzmanību!


    Komplement r s dns sint ze

    Kontroljautājums

    Nosauciet trīs praimeru veidus, kuri izmantojami, lai sintezētu pirmās ķēdes kDNS no mRNS?


  • Login