細胞分裂に伴う DNA 複製

細胞分裂に 伴うDNA複製

細胞核ゲノムミトコンドリアゲノムゲノムとは

遺伝子 (gene) ゲノム (genome) 染色体 (chromosome) ゲノムとは1つの核内の染色体に含まれる全DNAのこと

ヒト細胞１つに含まれるゲノムDNAの 全長は 2 m (30億 bp, 塩基対)に達する

増殖中の細胞は，全ゲノムDNAを正確に複製し，複製したDNAを増殖中の細胞は，全ゲノムDNAを正確に複製し，複製したDNAを核分裂，細胞分裂の過程を経て次世代細胞へ均等に分け伝える１）細胞は細胞分裂の前の細胞周期の適当な時期にゲノムDNAを正確に　　２倍にコピーする．この過程をDNA複製とよぶ．２）真核細胞では，DNA複製は細胞周期の特定の時期のみに起こり，　　ほかの細胞周期の事象と連動している３）忠実なゲノムの複製は，個体と種の保存に必須であると同時に，　　複製中に起きる変異は進化の原動力（分子進化molecular evolution）　　となる（分子系統学）４）この制御機構の破綻は，細胞死あるいは異常増殖につながる

二重らせん構造と半保存的複製機構 ワトソンとクリックにより提唱されたDNAの二重らせん構造は，DNA複製の基本原理となった(1953年) その遺伝子の複製とは，DNAはそれぞれの鎖を鋳型にして相補鎖を形成することで親鎖とまったく同じ塩基配列を持つ２本のDNAが正確に合成されるこの合成機構では次世代二重らせんDNAの片方の鎖に親DNA由来の鎖が保存されて行くので半保存的複製(semiconservative replication)と呼ばれる

１）分散型複製 ２）半保存的複製親二重らせん親DNA ３）保存的複製新生DNA DNA複製に関する３通りの仮説

15N標識DNA 14N標識DNA 等間隔 1:1の割合ゲノムDNA複製における半保存的複製機構の証明半保存的複製は，メセルソン-スタールの実験により証明された(1958年)

ゲノムDNA複製に関わる３段階 I ）開始 (initiation) DNA分子上の複製開始位置の確認 II ）伸長 (elongation) 親ポリヌクレオチドのコピーが作製される際に複製フォークで起きる反応 III ）終結 (termination) 親分子の複製の完了過程

様々な細胞種を用いた分子生物学の進展過程 哺乳類細胞ヒト細胞大腸菌酵母線虫原核生物真核生物 DNAが細胞質に散在 DNAが核に収納

I. ゲノムDNA複製における開始 (initiation) DNA分子上の複製開始位置の確認１）DNA合成は細胞の増殖に合わせて開始されるように　　　調節されているが，これはゲノムDNA上の複製起点　　領域に存在する複製装置において行われる２）細菌などの原核細胞ゲノムでは１カ所の，　　真核細胞ゲノムでは多数の複製起点がある

大腸菌 複製起点領域塩基配列 DNA複製の開始モデル；レプリコン仮説ジャコブ，モノー，クジンらのレプリコンモデル(1961年) DNA複製: DNA replication １）レプリコンとは複製の単位２）レプリコンは，イニシエーターと　　レプリケーターという２つの　　遺伝子座を持つ３）イニシエーターは正の制御因子　　としてレプリケーターに　　働きかける

細菌の環状染色体の複製 真核生物の線状染色体の複製複製起点は多数ヒトでは150kbあたり１つ存在する複製起点は１つ DNA複製における開始場所・DNA複製は，複製起点 (origin of replication)とよばれる特定領域　から開始される・複製は，ゲノムに２つの複製フォークが現れ，DNA上を互いに　反対方向に向け，両方向に進行する複製フォーク (Ｙ字型複製点)

oriC領域 二重らせんの開裂複製開始タンパク質, DnaA結合部位 5’-GATCTNTTNTTTT-3’ 5’-TT(A/T)T(A/C)CA(A/C)A-3’ 大腸菌の複製開始に必要な最小DNA領域, oriCの構造（245bp) 大腸菌の複製起点(oriC)における複製開始（１）

二重らせんの開裂 複製開始タンパク質, DnaA結合部位大腸菌の複製起点における複製開始（２） oriC領域にDnaAが結合した後に，二重らせんの開裂が起きるこの開裂を引き金として，複製機構の中の伸長反応が起きる

複製起点認識複合体 (ORC)の結合部位 (ORS) 真核細胞の複製起点における複製開始（１）二重らせんの開裂誘導タンパク質結合部位二重らせんの開裂領域酵母の複製開始に必要な複製起点配列自律複製配列(autonomously replicating sequence; ARS)の構造（200bp以下) 酵母の ARSは４種類知られ，領域Aと領域B1は，複製起点認識配列(origin recognition sequence; ORS)と呼ぶ＊ ORC ; origin recognition complex

B3 B2 B1 A ABS1結合による開裂の誘導真核細胞の複製起点における複製開始（２）複製起点認識複合体複製起点認識複合体 (ORC; 6種のタンパク質)は，DNA複製の開始と細胞周期のタイミングを合わせる調節シグナルとの仲介を行うヒトをはじめとする高等真核生物の複製起点の解明は進行中である＊ ORC ; origin recognition complex

II. ゲノムDNA複製における伸長 (elongation) 親DNA鎖のコピーの際に複製フォークで起きる反応１）細胞は非常に早く，かつ正確に全ゲノムDNA鎖の合成（伸長反応）　　を進めるDNA複製の中心舞台２）DNA複製が開始されると，複製フォークがDNAに沿って移動し，　　既存のポリヌクレオチド鎖に相補的なDNA新鎖を合成する過程

複製フォーク ２本鎖のDNAが分離し，そこにデオキシリボヌクレオチドが付加されて新たに２本鎖DNAが形成される領域を複製フォークという伸長反応の最前線

大腸菌のDNA複製過程に見られる複製フォーク 真核細胞のDNA複製は直鎖状で，かつ複製フォークが多数存在する

複製フォーク (Ｙ字型複製点) DNAトポイソメラーゼIが複製フォークの進行方向にある片方の鎖に切れ目を入れる複製が進行 DNA合成が継続二重らせんの開裂とDNA複製 DNAトポイソメラーゼ二重らせんは分子そのものを旋回させることなく，ジッパーを開けるがごとく二本の鎖が左右に引き離され，DNAが合成されて行く

DNA トポイソメラーゼ II の活性にはATPが必要 DNAの二重らせんがねじれて絡まり合った領域（DNA超らせん）の数や位相を調節する酵素

I 型 DNAトポイソメラーゼによるDNAトポロジーの解消（１）１）IA 型トポイソメラーゼ（一本鎖DNA）一方のポリヌクレオチド鎖を切断し，生じた裂け目を，他方のポリヌクレオチド鎖に通過させる．その後に切断鎖の両端が再び結合される酵素反応２）IB 型トポイソメラーゼ（一本鎖DNA） IA 型トポイソメラーゼと同様の作用を示す．進化の過程で違いが生じた酵素反応

II 型 DNAトポイソメラーゼによるDNAトポロジーの解消（２）３）II 型トポイソメラーゼ（二本鎖DNA）二重らせんの両端を切断し，第二のらせん断片が通り抜ける入り口を形成する DNAトポイソメラーゼ自体が二重らせんを”巻き戻す”わけではなく，複製の進行により生じる”分子のねじれ応力”を是正する働きをする

伸長反応におけるDNAポリメラーゼ（１） 5’→3’ DNA合成 DNAポリメラーゼが触媒する化学反応は，DNAポリヌクレオチドの5’→3’方向の合成である

DNAポリメラーゼによるDNA伸長反応 プライマー鎖鋳型鎖 DNA伸長にはDNAポリメラーゼを必要とする DNA伸長反応 DNAポリメラーゼ反応１）鋳型DNAを要求する２）基質にデオキシリボヌクレオシド 5’三リン酸(dNTP)を用いるピロリン酸３）脱ピロリン酸反応によりdNMPとし，　　プライマー鎖の3’-水酸基末端に　　リン酸ジエステル結合により付加する　　（ 5’ →3’伸長）４）DNAポリメラーゼのDNA伸長反応は， 5’→3’方向の一方向合成（ 5’ →3’伸長）

エキソヌクレアーゼ活性 酵素機能 3’→ 5’ 5’→3’ 細菌のDNAポリメラーゼありあり DNAポリメラーゼ I DNA修復，複製ありなし DNAポリメラーゼ II DNA修復真核生物のDNAポリメラーゼありなし DNAポリメラーゼ III 主要DNA複製酵素なしなし DNAポリメラーゼ α 複製時のプライミングなしなし DNAポリメラーゼ β DNA修復なしありミトコンドリアDNA複製 DNAポリメラーゼ γ なしあり主要DNA複製酵素 PCNAとともに機能する DNAポリメラーゼ δ PCNA；proliferating cell nuclear antigen増殖細胞核抗原ありなし DNAポリメラーゼ ε DNA複製伸長反応におけるDNAポリメラーゼ

DNA ポリメラーゼ 一本鎖のDNA鎖を鋳型として相補的に5’→3’ 方向にデオキシリボヌクレオチドを付加して新しい２本鎖DNAを形成する酵素付加反応開始には， DNAやRNAのプライマー鎖を必要とする DNAを右手につかんでいるかのような構造をしている

3’ 5’ 5’ 3’ 不連続複製機構と岡崎フラグメント複製フォークでの娘鎖の伸長方向は， 5’→3’方向と3’ → 5’方向のものがある DNAポリメラーゼの伸長方向は， 5’→3’方向のみである DNA複製では，二重らせんの両鎖のコピーが作製される必要がある 3’ → 5’方向の伸展には，不連続複製を行う

3’ 5’ 5’ 3’ 伸長反応におけるリーディング鎖とラギング鎖 5’→3’方向に短い DNA合成を行い，後にDNAリガーゼでつないで新生(娘) DNA鎖を合成する（不連続複製） DNAポリメラーゼによる5’→3’方向の連続したDNA鎖合成岡崎フラグメント 1000bp以下（岡崎令治博士 1969年）リーディング鎖ラギング鎖 Leading 先行鎖 Lagging 遅延鎖

伸長反応におけるプライマー プライマー (primer）:　火種，点火装置鋳型依存性DNAポリメラーゼは，一本鎖DNA分子からDNA合成ができないので，短い２本鎖部分（プライマー）を必要とするリーディング鎖における相補的合成開始においても，ラギング鎖での不連続DNA断片の合成においてもプライマーが必須であるリーディング鎖ラギング鎖

DNA複製フォークで働くタンパク群 DNAポリメラーゼが働くためには親DNA鎖に相補的な約10ヌクレオチドの RNAプライマーが必要二重鎖をほどく 5’ RNAポリメラーゼのひとつでプライマー RNAを合成する 1本鎖状態の維持 3’ DNAポリメラーゼ III RNA-DNA雑種分子合成 DNAポリメラーゼ I RNAをDNAに変換

複製複合体をレプリソームとよぶ DNAトポイソメラーゼ超らせんのよじれの解消 Single-strand DNA binding protein 一本鎖への塩基結合の阻止 helicase 二重鎖の巻き戻し DNA合成が遅延しているラギング鎖では，複製フォーク部位でループを作ることでリーディング鎖と合成部位が揃い（同調）二量体を形成するプライマーRNAは RNase Hにより除去 DNA複製フォークでの二量体形成

DNA ヘリカーゼ (helicase) の構造と機能 DNA ヘリカーゼは6量体で環状構造をとる 6量体の中心を片側のDNAの一本鎖が通り、その5’→3’方向に進むことによって２重らせんをほどいて一本鎖とする ATP加水分解で放出されるエネルギーを用いて DNA２本鎖をほどく酵素

複製を繰り返すたびに起きる線状DNA分子の末端の短縮化が進む複製を繰り返すたびに起きる線状DNA分子の末端の短縮化が進む最終の岡崎フラグメントは合成されないので，複製は不完全であるラギング鎖コピーの複製末端DNA 線状DNA分子の末端構造の保持 RNAプライマー配列に依存する

3’ 5’ リーディング鎖 5’ 3’ ラギング鎖 3’ 5’ 5’ 3’ ラギング鎖リーディング鎖 5’ 3’ 3’ 5’ 不連続複製では完全に複製できずに，染色体は複製のたびに短くなってゆく

テロメア telomere 正常培養細胞の分裂寿命は、細胞自身が持つ染色体上のテロメア短縮のために起こる。真核生物の染色体末端に存在する特殊な塩基の反復配列 (5’-TTAGGG-3’) テロメアは染色体末端部分に位置し、5’-GGTTAG-3’の６塩基を数千回繰り返す配列として存在するがん細胞では、hTERT (human telomerase reverse transcriptase) 遺伝子から、テロメラーゼ（telomerase）が作られ、5’-GGTTAG-3’を伸長する。テロメラーゼは，がん細胞と正常幹細胞にのみ発現している

テロメラーゼは， RNAと タンパク質から成り，RNAは伸展過程での鋳型となり，タンパク質の逆転写酵素はDNA合成を司るテロメアDNA合成転写テロメラーゼ活性の調節は，テロメア結合タンパク質 (telomere binding protein; TBP)により調整を受ける．これがなければ，複製に伴う末端短縮と同様に染色体の欠損を招く新しいテロメアDNA鎖の合成

正常細胞 がん細胞や幹細胞死滅死滅死滅無限増殖・自律的増殖

ヘンリエッタ・ラックス （1951年、31歳） HeLa 細胞 (子宮頸部がん, 1951年）がん細胞におけるテロメアの生成

III. ゲノムDNA複製における終結 (termination) 親DNA鎖の複製の完了過程複製フォークは線状ゲノムに沿って進行して行くが，転写中の領域に至ると進行が停止する DNA合成はRNA合成の５倍の速度で行われるが，複製複合体は DNAポリメラーゼを追い抜くことはなく，複製フォークは RNAポリメラーゼの後方で転写が終わるのを待つしかしながら，真核生物の複製終結についての知見は現在進行中である

DNA複製の終結 細菌のゲノム複製は，一定の起点から開始し，両方向に進行する × 細菌のゲノム複製は特定領域内で終結するのでこのような複製は起きない細菌の環状染色体の複製複製起点は１つなぜならばゲノムにはフォークの進行を停止する終結配列 (terminal sequence)があるため

複製フォークが 進行を停止する領域複製フォークが別の複製フォークを追い抜けない理由ゲノムの周りを一方向に移動する複製フォークは通過させるが，その反対方向に動くフォークは進行を停止させる

ゲノムの複製と細胞周期の連動 １．複製は細胞周期の進行と連動しており，細胞分裂が起こる時点で　　ゲノムのコピー２組が準備されている２．複製過程そのものが，ある条件下で停止することがある．　　たとえば，DNAの損傷が生じ，コピー完了前に修復する必要が　　ある時などである

体細胞分裂（１） 前期前中期中期核の中ではゲノムDNA が複製され凝縮する．核外では、紡錘体が形成される．核膜が分散し，染色体は動原体を介して紡錘糸に結合する２つの紡錘体極のほぼ中間付近 (赤道面)に染色体が並ぶ

体細胞分裂（２） 後期終期細胞分裂期対をなす染色体が紡錘糸により二つに分かれ紡錘体極に移動染色体が紡錘体極に到し，核膜を再形成する．また細胞質分裂に関係する収縮管を形成終期に形成した収縮管が縮み細胞が分裂して細胞分裂を終了

間期 Interphase 前期の終わり Late prophase 終期 Telophase セントロメア体細胞分裂微小管中期 Metaphase 後期 Anaphase 染色体の分裂は間期に起き，DNAが遺伝物質として同定されると間期はゲノム複製の起こる過程として認識され，細胞周期の概念が構築された

１．分裂期 (mitosis)あるいはM期 (M phase) 核や細胞が分裂する過程２．ギャップ１期 (Gap １)あるいはG1期 (G1 phase) 転写や翻訳，その他の通常見られる細胞の生理活性事象が起こる準備過程細胞周期３．合成期 (synthesis)あるいはS期 (S phase) ゲノム複製が起こる過程４．ギャップ２期 (Gap ２)あるいはG2期 (G2 phase) 第二の準備過程細胞周期＊ S期とM期に移行する直前の時期は，細胞周期チェックポイント (cell cycle checkpoint)であり，DNA損傷などの修復不可能な　傷害があれば，細胞周期はチェックポイントで停止する

DNA複製を調節する サイクリンの細胞周期におけるチェックポイントＳ期サイクリン細胞周期細胞周期とサイクリン１）細胞周期の制御を担うのは，細胞周期において特異的機能を示す酵素や　　タンパク質をリン酸化して活性化するタンパク質キナーゼである２）同一のキナーゼが細胞周期を通じて核内部に存在するので，キナーゼ活性の　　有無が細胞周期を制御する３）このキナーゼ制御には，細胞周期の時期により存在量の異なる　　サイクリンやサイクリン依存性キナーゼを活性化する別のキナーゼ，　　そして阻害タンパク質が関わる

サイクリンと活性のある複合体を形成するCdk サイクリン活性化複合体を形成するCdk Cdc 2 (Cdk 1), Cdk 2 A Cdc 2 (Cdk 1) B Cdk 8 C D Cdk 4, Cdk 6 Cdk; cyclin-cyclin dependent kinase Cdk 2 E F 不明 G 不明不活性化 CDK 活性化 CDK CDK MO 15, Cdk 7 H サイクリンサイクリン結合サイクリン分解

細胞分裂に伴う DNA 複製