3.6 Genų identifikacija ir funkcijos nustatymas, genolapiai

1. 3.6 Genų identifikacija ir funkcijos nustatymas, genolapiai

2. Tam tikras pozicinio klonavimo taikymo kartografuojant, pvz. žmogaus, genus būdas yra vadinamasis ‘kandidatinių genų’ metodas. Šiuo atveju nustatoma tam tikro požymio fenotipo sankiba su konkrečiu chromosomos regionu, kuriame jau anksčiau buvo surastas kokį nors baltymą koduojantis genas. Belieka vieną ar kelis genus, esančius tame chromosomos regione, susieti su tiriamo požymio fenotipu. Kandidatinių genų identifikavimas Kandidatiniaigenai Susietumo tyrimai Genolapiųsegregacija Kandida-tinio geno paieška tarp kandidatinio geno žymens ir lokuso apsprendžiančio požymio variaciją (QTL) tarp kandidatinio geno polimor-fizmo ir požymio variacijos Genolapių sulyginimas Genetinė transformacija Fiziologinė analizė Kandidatinio geno tikrinimas C.Plomion_CD material_2002

3. Silpniausia grandis, kadangi reikalingi ilgalaikiais eksperimentais paremti duomenys http://www.stats.ox.ac.uk/~hein/HumanGenome/cardon.pdf

4. Genomas išreikštas genomas Adaptacija DNR mRNR Baltymai 2/ mRNRir baltymo sukaupimas 1/ Geno seka Apytiksliai 30000 genų pas aukštesniuosius augalus Genai atsakingi už sausros streso atsaką ir, dar svarbiau, už atsparumą C.Plomion_CD material_2002

5. Kandidatiniai genai būna: • Funkciniai kandidatiniai genai • (žinomi genai, modelinės rūšys) • Išraiškoskandidatiniai genai 1/ išreikšti tam tikrose augalo dalyse bei vystymosi stadijose 2/ išreikšti tam tikromis sąlygomis normaliai drėkinama nelaistoma C.Plomion_CD material_2002

6. žiedadulkės pumpurai Baltymai šaknys ksilema 25% 2% 18% 22% 7.2% 12.5% 45% 83% 8% 1% 12% 7.6% 35% 10.6% spygliai spygliai Spec. ksilemos ir šaknų baltymų profiliai mRNR 1/ išreikštumas tam tikruose audiniuose • Ksilemos EST duomenų bazėse (70000 P. taeda + 10000 P. pinaster) • Šaknų EST (20000 P. pinaster) C.Plomion_CD material_2002

7. 2/ genai išreikšti tam tikromis sąlygomis « identifikacijagenų atsako sausrai » MEDIENA (savybės) SAUSRA Tyrimai • du bandymo režimai: • normalaus drėkinimo • sausros imitacijos • cDNR-AFLP 6 medienos tipai Metodika 10,000ksilemosEST iš cDNR bibliotekos (6 medienos tipai, 6 genotipai) EST (šaknys ir spygliai) • rendomizuotas EST sekvenavimas • genų išraiškos profiliavimas Transkriptomikair proteomika C.Plomion_CD material_2002

8. Suktaspyglės pušies (Pinus contorta) pridėtinių šaknų vystymosi (Brinker et al. 2004) tyrimams buvo parinkta 2178 cDNR sekos iš Pinus taeda cDNR bibliotekų. Viena iš dvylikos cDNR kategorijų buvo parinkta pagal jų funkciją, naudojantis homologinėmis sekomis iš Arabidopsis genomo bibliotekos. A – 4 savaičių pušies hipokotilis (poskiltis), B – skersinis hipokotilio pjūvis įvairiose vystymosi fazėse

9. Skirtingai pasireiškusių atskirose pridėtinių šaknų vystymosi fazėse genų skaičius 220 ekspresuotų genų pasireiškimas, skirstant juos į dvi grupes pagal ekspresiją atskirose šaknų vystymosi fazėse 220 genų transkripcijos lygis žymiai padidėjo ar sumažėjo ir daugumos (183 iš 220) jų ekspresija pasikeitė skirtingose šaknų vystymosi stadijose.

10. EST mikrogardelių metodu galima tirti su medžių lytine branda susijusius genus (Campbell et al. 2003). Yra žinoma, kad potencialių reguliacinių genų ekspresija labai skiriasi skirtinguose augalo audiniuose, skirtingose vystymosi stadijose ir įvairiose aplinkos sąlygose. Fotoperiodizmas augaluose

11. Miško medžių rūšių domestikacija Dauguma aukštesniųjų organizmų turi genome vidutiniškai apie 30 000 genų. Tik mažos jų dalies funkcijos yra žinomos. EST ar genomo sekos Mikrogardelių ekspresijos studijos Kandidatinių genų identifikavimas Funkcinė analizė panaudojant transgeninius medžius (galimai) Fenotipinė analizė panaudojant lauko ar šiltnamio bandymus Genetinio atsako tikslinimas Selekcionuoti varietetai, selekcija genų pagrindu (GAS)

12. Funkciniai kandidatiniai genai • (žinomi genai, modelinės rūšys) Modeliniai genomai ir modelinės rūšys ar organizmai: Kas apsprendžia modelinio genomo tinkamumą? • Genomas turi būti nedidelis ir neturėtų būti daug kartotinių sekų • Eukariotuose: diploidinis genomas yra tinkamas genetinių kryžminimų sekimui Kas apsprendžia modelinės rūšies ar organizmo tinkamumą? • Techninės priemonės ir metodai genetinėms manipuliacijoms atlikti (transformacijos, mutacijos, genų klonavimas ir pan.) • Išauginimo ir dauginimo laboratorijos sąlygomis paprastumas • Sąlyginai trumpas vienos generacijos laikas • Modelinis organizmas turi būti artimas tiriamajam http://www.genetik.uni-bielefeld.de/~/Genome_Research_WS2005_06/

13. Populus yra viena iš modelinių rūšių svarbių miškininkystei Dabartiniu metu didelis dėmesys skiriamas eukalipto sekvenavimui ir EST duomenų bazės kūrimui http://www.genetik.uni-bielefeld.de/~/Genome_Research_WS2005_06/

14. Ar genetinė transformacija visada yra įgyvendintina? • Genetinė transformacija yra efektyvi tuopoms: – stabili transgeninė ekspresija, maža somakloninė variacija • Svarbiausias medžių rūšis yra sunku genetiškai transformuoti ir regeneruoti: – svarbių reguliatorinių genų reikšmę sunku interpretuoti pagal modelinių rūšių transformacijas • Tyrimai transformacijos srityje yra labai svarbūs genominei medžių biologijai: – efektyvumas, reguliavimas, saugumas http://gcep.stanford.edu/pdfs/energy_workshops_04_04/

15. UniGene yra eksperimentinė sistema automatizuotai suskirstanti Genų banko (GenBank) sekas į genams priskiriamus klasterius. Kiekvienas UniGene klasteris talpina sekas būdingas atskiram genui, taip pat papildoma aktuali informacija apie audinių kultūrą, kurioje genas buvo išreikštas, ir vietą genolapyje. UniGene bazėje yra 72rūšys (2006 metų pradžios duomenys), visoms šioms rūšims surasta daug išreikštų genų sekų (EST). Susiję su UniGene duomenų bazės: Gene, HomoloGene, dbEST, Trace Archive. Nedidelis kiekis išnykusių gyvūnų rūšių (pvz, mamuto, kardadančio tigro) DNR sekų taip pat yra padėta Genų Banke. RūšisUnigene klasteriai Picea glauca6,867 Picea sitchensis6,907 Pinus taeda14,198 Malus x domestica17,180 Populus balsamifera11,310 Populus tremula x7,641Populus tremuloides Pinus taeda 14 198 iš viso rinkinių 89 rinkiniai talpinantys bent vienąRNR 14 188 rinkiniai talpinantys bent vieną EST 79 rinkiniai talpinantys ir mRNR ir EST 229 620 viso sekų klasteriuose

16. Pirmi 20 organizmų dbEST duomenų bazėje (2002 metų duomenys) Organizmas (rūšis) EST klasteriai Homo sapiens (žmogus) 4,070,035 Mus musculus (pelė) 2,522,776 Rattus norvegicus (žiurkė) 326,707 Drosophila melanogaster (vaisinė muselė) 255,456 Glycine max (soja) 234,900 Bos taurus (jautis) 230,256 Danio rerio (žuvų rūšis) 197,630 Xenopus laevis (varlių rūšis) 197,565 Caenorhabditis elegans (nematodas) 191,268 Lycopersicon esculentum (pomidoras) 148,338 Zea mays (kukurūzas) 147,658 Medicago truncatula (žolinis augalas) 137,588 Arabidopsis thaliana (žolinis augalas) 113,330 Chlamydomonas reinhardtii 112,489 Hordeum vulgare (miežiai) 104,803 Oryza sativa (ryžiai) 104,284 Sus scrofa (kiaulė) 103,321 Anopheles gambiae (moskitų rūšis) 88,963 Ciona intestinalis (moliuskų rūšis) 88,742 Sorghum bicolor (sorgas) 84,712 Pontius et al. 2003

17. Pavy et al. 2005 Daugumos medžių rūšių ypatumai: • Didelė požymių morfologinė variacija • Ilgaamžiškumas • Ribotas eksperimentinių kryžminimų kiekis • DNR variantų 5 kartus daugiau nei žmogaus genome • Nedideli tarppopuliaciniai skirtumai • Neatsitiktinė genų sankiba (angl. linkagedisequilibrium) ~1500bp (Brown et al. 2004) http://www.woodwisdom.fi/content/Events/Forest_Biotechnology_Seminar01022006/

18. Žmogaus ir medžių genolapių sudarymas Išvengiama dirbtinio kryžminimo Populiacijų duomenys su besiskiriančiais fenologiniais duomenimis Istoriškai susiklosčiusi mažiau sudėtinga medžių rūšių populiacinė struktūra Medžiams būdinga daug mažesnė neatsitiktinė genų sankiba (tai leidžia identifikuoti mažesnes DNR sekas susijusias su fenotipiniu požymiu) Medžių tyrimai turi būti grindžiami kandidatinių lokusų analize J.N. Hirschhorn and M.Daly (2005) • Tiesioginis susiejimas atskiro polimorfinio nukleotido (SNP) su fenotipiniu požymiu; • Netiesioginis susiejimas atskiro polimorfinio nukleotido (SNP)su fenotipiniu požymiu, pasinaudojant neatsitiktine genų sankiba (angl. linkage disequilibrium). Žmogaus tyrimai gali naudoti neatsitiktinę genų sankibą ir susietas DNR sritis ar vietas, nepriklausančias tam pačiam genui. Medžių tyrimuose turi būti naudojamos DNR sritys to paties geno ribose Neale and Savolainen (2004)

19. Šešta grupė Quercus roburgenolapiai Ąžuolo genolapiai buvo sudaryti panaudojant 271 RAPD, 10 SCAR, 18 SSR, 1 minisatelitinį, 6 enzimų ir 1 5S rDNA žymenį. Buvo tiriami 94 medžiai iš sibų šeimų. Šie genolapiai bus panaudoti molekuliniams tarprūšinės ir vidurūšinės ąžuolo rūšių diferenciacijos tyrimams, o taip pat adaptyvinių požymių QTL identifikavimui. Barreneche et al. (1998) http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/

20. Eucalyptus urophyllairE. grandisgenolapiai Genolapiai, sudaryti panaudojant tarprūšinę hibridizaciją, pasitarnaus identifikuojant kandidatinius genus, pavyzdžiui, medienos savybių (lignifikacijos) QTL nustatymui. Plačiau aprašyta Cervera et al. 2000. Gion et al. 2000

21. http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/

22. Taip vadinami inkariniai lokusai (angl. anchor loci) panaudojami sudarant bendrą, pvz. pušų, genolapį, kuris gali būti panaudotas giminingų rūšių genomų struktūros ir evoliucijos tyrimams. Viena iš dvylikos genolapio sankibos grupių (LG1), sudaryta pagal Pinus contorta polimorfinių išreikštų genų sekų (ESTP) inkarinius lokusus. Sėkminga PGR amplifikacija atitinkamose pušies rūšyse pavaizduota apskritimais: užpildyti parodo lokuso polimorfiškumą, o neužpildyti – monomorfiškumą. G. R. Brown et al. 2001

23. Paveldėjimo ir genolapių sudarymo studijos plikasėklių augalų rūšims (01/2004 duomenys) http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/

24. http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/

25. http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/

26. http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/

27. Kandidatinių genų identifikavimo metodas taip pat turi trūkumų, taikant jį augalų genetiniuose tyrimuose: • tiriamus požymius sąlygojantys fiziologiniai procesai dažnai yra mažai ištirti ir tai riboja kandidatinių genų parinkimą • fiziologinių procesų skaidymas į atskirus etapus būtų optimalus būdas, tačiau ne visada tą yra įmanoma atlikti • kuo daugiau kandidatinių genų/lokusų yra nustatoma genolapiuose, tuo didesnė tikimybė, kad ko-segregacija gali pasitaikyti tiesiog atsitiktinai • detali sankibos grupių analizė gali būti atlikta tik didelėje populiacijoje tam, kad patikrinti ir pagrįsti kandidatinį geną. Daugėjant duomenų EST bazėse ir atsirandant naujų mikrogardelių metodų, vis daugiau kandidatinių genų bus galima identifikuoti. Pflieger et al. 2001

28. Literatūros sąrašas Barreneche T, Bodénès. C, Lexer C, Trontin J F, Fluch S, Streiff  R , Plomion C, Roussel G, Steinkellner H, Burg K, Favre JM, Glössl J and Kremer. A. 1998. A genetic linkage map of Quercus robur L. (pedunculate oak) based on RAPD, SCAR, microsatellite, minisatellite, isozyme and rDNA markers. Theor Appl genet 97:1090-1103. Brown G.R., Gill G.P., Kuntz R.J., Langley C.H. and Neale D.B. 2004. Nucleotide diversity and linkage disequilibrium in loblolly pine. PNAS 101 (42): 15255–15260. BrownGR., KadelEE. III, BassoniDL., KiehneKL., TemesgenB., BuijtenenJP. van, SewellMM., MarshallKA., NealeDB., vanBuijtenenJPAD 2001. Anchored reference loci in loblolly pine (Pinus taeda L.) for integrating pine genomics.Genetics, 159 (2): 799-809. Campbell M.M.,Brunner A.M., Jones H.M. and Strauss S.H. 2003. Forestry’s fertile crescent: the application of biotechnology to forest trees. Plant Biotechnology Journal 1:141-154. Cervera MT., Plomion C., Malpica C. 2000. Molecular markers and genome mapping in woody plants. In : Jain SM and Minocha SC (eds.), Molecular Biology of Woody Plants, Volume 1, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. Pp.:375-394. Gion J-M., Rech P., Grima-Pettenati J., Verhaegen D., Plomion C. 2000. Mapping candidate genes in Eucalyptus with emphasis on lignification genes. Mol Breed 6: 441-449. Neale DB. and Savolainen O. 2004. Association genetics of complex traits in conifers. Trends in Plant Science 9: 325-330.

29. Naudota literatūra Pavy N., Paule Ch., Parsons L., Crow J.A., Morency M-J., Cooke J., Johnson J.E., Noumen E., Guillet-Claude C., Butterfield Y., Barber S., Yang G., Liu J., Stott J., Kirkpatrick R., Siddiqui A., Holt R., Marra M., Seguin A., Retzel E., Bousquet J. and MacKay J. 2005. Generation, annotation, analysis and database integration of 16,500 white spruce EST clusters. BMC Genomics 6 (144): 1-19. Pflieger S., Lefebvre V., Causse M. 2001. The candidate gene approach in plant genetics: a review. Molecular Breeding 7: 275–291. Pontius J.U., Wagner L. and Schuler G.D. 2003. UniGene: A Unified View of the Transcriptome. Rančelis V. 2000. Genetika. Lietuvos Mokslų Akademijos leidykla, Vilnius. Pp. 662. Savolainen O. 2006. Genetic basis of natural variation: international projects. (ppt presentation) http://www.woodwisdom.fi/content/Events/Forest_Biotechnology_Seminar01022006/ Steane D. 2005. Complete Nucleotide Sequence of the Chloroplast Genome from the Tasmanian Blue Gum, Eucalyptus globulus (Myrtaceae). DNA Research 12: 215-220. Strachan T. and Read A.P. 1999. Human Molecular Genetics. John Wiley & Sons, second edition. Vasemägi A. and Primmer C. R. 2005. Challenges for identifying functionally important genetic variation: the promise of combining complementary research strategies. Molecular Ecology 14: 3623–3642.