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RNAi nterference ( RNAi )

RNAi nterference ( RNAi ). Gerard Sellarés Martínez Módulo 6 – Genómica y Proteómica. Antecedentes. ?. 1990 R. Jorgensen. 1995 Guo S & Kemphues KJ. 1998 Andrew Fire & Craig Mello.

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Presentation Transcript

  1. RNAinterference (RNAi) Gerard Sellarés Martínez Módulo 6 – Genómica y Proteómica

  2. Antecedentes ? 1990 R. Jorgensen 1995Guo S & Kemphues KJ 1998 Andrew Fire &Craig Mello 1990 R. Jorgensen“Introduction of a ChimericChalconeSynthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans.” Plant Cell 1998 FireA, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC.Potent and specificgenetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditiselegans.Nature. 1998 1995GuoS, Kemphues KJ. ”par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thrkinase that is asymmetrically distributed” .Cell

  3. Introducción La ribointerferenciao interferencia del RNA es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes específicos, ejercido por moléculas de RNA que, siendo complementarias a un RNA mensajero (mRNA), conducen habitualmente a la degradación de éste (Fire and Mello,1998) dsRNA siRNA (19-23 pb) shRNA miRNA

  4. Chemistry & Biology 19, January 27, 2012

  5. Componentes del mecanismoRNAi • Naturereviews, February 11, 2012

  6. Mecanismos de silenciamiento Amplificaciónde la señal En plantas, hongos y C. elegans Se generan nuevas moléculas de siRNA (secundarias), específicas para diferentes secuencias del mismo mRNA, generando un efecto de amplificación Resistencialas infecciones virales

  7. Mecanismos de silenciamiento Ensamblaje de heterocromatina mediante RNAi en S. pombe Estas secuencias repetitivas y los cenRNAs atraen enzimas como la Histona Metil-Transferasa (HTMasas, de las siglas en inglés) tipo H3K9 (metilan la lisina9 de la histona H3), proteínas HP1 y otros complejos que median la formación de heterocromatina. Nature 457, 413-420(22 January 2009)

  8. Utilización en el laboratorio Silenciamiento de genes (“Knockdown") Se sintetiza dsRNA (o siRNAs/shRNAs en mamíferos) con una secuencia complementaria a la del gen de interés y se introduce en una célula u organismo, donde se reconoce como material genético extraño, lo que activa la ruta del RNAi.

  9. Utilización en el laboratorio Obtención de una línea de ratones transgénicos para RNAi

  10. Aplicaciones Terapias antivirales (Expresión génica viral en células cancerosas, HIV, Hepatitis A y B, etc) Terapias en enfermedades neurodegenerativas (Enfermedad de Hungtington). Terapia contra el Cáncer Medicina Genómica funcional C. Elegansy Drosophilacomo animales modelo (también Plantas). Mapeo y construcción de librerías genómicas de RNAi Biotegnología Diseño de plantas alimenticias Aprovecha el fenotipo estable y heredable del RNAi en plantas

  11. Ventajas Fácil de utilizar Rapidezen la obtención (algunosdías) Disminuye tiempo, “coste” y aumenta la especificidad Válido en experimentosin vivoe in vitro Viable en cualquiertipocelular La eficacia del sistema de interferencia radica en que RISC cataliza múltiples ciclos de interferencia in vivo

  12. Inconvenientes Estabilidad Rápidaeliminación Sensible a las nucleasas presentes en el plasma Vida mediacorta Limitacionesen el uso in vivo Administración (Deben estar protegidos) Off-target (OTEs) Reducción no intencionada de la expresión Para hacer el knockdown se necesitan dosis muy elevadas. OTE son dosis dependientes Generación de respuesta inmune (respuesta vía INF, secuencias CpG, etc)

  13. Bibliografía • Burnett JC, Rossi JJ. RNA-based therapeutics: current progress and future prospects.Chem Biol. 2012 Jan 27;19(1):60-71. Review • Fattal E, Bochot A. Antisense oligonucleotides, aptamers and SiRNA: promisesforthetreatment of ocular diseases.ArchSocEspOftalmol. 2006 Jan;81(1):3-4, 5-6. English, Spanish.  • Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specificgenetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditiselegans. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11.  • GuoS, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thrkinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995 May 19;81(4):611-20.  • Guo S, Kemphues KJ. A non-musclemyosinrequiredforembryonicpolarity in Caenorhabditiselegans. Nature. 1996 Aug 1;382(6590):455-8.

  14. Bibliografía • Hall IM, Noma K, Grewal SI. RNA interference machineryregulateschromosomedynamicsduring mitosis and meiosis in fissionyeast. ProcNatlAcadSci U S A. 2003 Jan 7;100(1):193-8. Epub 2002 Dec 30. • Hannon GJ. RNA interference. Nature. 2002 Jul 11;418(6894):244-51. Review. • Kole R, Krainer AR, Altman S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.NatRevDrugDiscov. 2012 Jan 20;11(2):125-40. doi: 10.1038/nrd3625. Review. • Lee SK, Siefert A, Beloor J, Fahmy TM, Kumar P. Cell-specific siRNAdeliverybypeptides and antibodies.MethodsEnzymol. 2012;502:91-122. Review.  • Singh S, Narang AS, Mahato RI. Subcellular fate and off-target effects of siRNA, shRNA, and miRNA.Pharm Res. 2011 Dec;28(12):2996-3015. Epub 2011 Oct 28. Review. • Sobala A, Hutvagner G. Transfer RNA-derived fragments: origins, processing, and functions.WileyInterdiscipRev RNA. 2011 Nov-Dec;2(6):853-62. doi: 10.1002/wrna.96. Epub 2011 Jun 30. Review. • Wang Z, Rao DD, Senzer N, Nemunaitis J. RNA interference and cancertherapy.Pharm Res. 2011 Dec;28(12):2983-95. Epub 2011 Oct 19. Review. • Zeller SJ, Kumar P. RNA-based gene therapy for the treatment and prevention of HIV: from bench to bedside. Yale J Biol Med. 2011 Sep;84(3):301-9. Review

  15. Grácias por suatención PREGUNTAS

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