Gene expression

1. Gene expression • מדידת ביטוי באמצעות מדידת כמות mRNA • זהו השלב הראשון בתהליך בקרת הביטוי • קל יותר לביצוע בקנה מידה גדול לעומת מדידת כמות חלבונים • חסרון – לא תמיד מייצג באופן ישיר את כמות התוצר הסופי

2. DNA Chips • מבנה ה-Chip • ביצוע הרבה ניסוי היברידיזציה במקביל • מודד עוצמת ביטוי יחסית • בניית פרופיל ביטוי • גנום ידוע => פרופיל ביטוי של כל הגנים • מטריצת הביטוי ונרמול התוצאות • הפחתת רקע • טרנספורמצית log

3. Clustering • עיבוד המידע הרב דורש טכניקות חישוביות חדשות • העקרון – קיבוץ גנים בעלי תבנית ביטוי דומה בצבר אחד. • מתייחסים לכל גן כאל וקטור n-מימדי • הגדרת פונקציית מרחק ("דימיון") בין כל שני גנים, כגון: • מרחק אוקלידי • מקדם המתאם • Hierarchical Clustering • מצא את 2 הצברים הקרובים ביותר • חבר אותם לצבר יחיד ע"י ענף חדש שאורכו תואם את רמת הקרבה • חשב מחדש את הקרבה של כל הצברים הנותרים

4. Clustering – The result • דימיון ברמה הויזואלית • ייצוגים חוזרים של אותו הגן על ה-chip מופיעים בסמיכות • גנים בעלי דימיון פונקציונלי ידוע מופיעים באותו הצבר, למשל: • גליקוליזה • היסטונים • הכפלת DNA • רגישות רבה לתבנית הביטוי • אבחנה דקה בין תבניות ביטוי שונות • השפעת הרעש נמוכה יותר • ביטוי דומה מרמז על בקרה דומה

5. Clustering vs. Random data

6. האורגניזם הנחקר – שמר האפייה חד-תא, חייב לפתח מנגנוני תגובה מהירים לשינוי בתנאי הסביבה בעל רצף גנומי ידוע, 6220 גנים ו-ORFs יש מידע רב שכבר ידוע על אורגניזם זה, הרבה גנים שכבר מאופיינים מטרות: חקר התגובה והאדאפטציה של של התאים לתנאי עקה שונים חקר הבקרה של התגובה התאית לתנאי עקה Genomic Expression Programs in the Response of Yeast Cells to Environmental ChangesAudrey P. Gasch, Paul T. Spellman, Camilla M. Kao, Orna Carmel-Harel, Michael B. Eisen, Gisela Storz, David Botstein, and Patrick O. Brown

7. הניסויים שבוצעו • תנאי הניסוי: • עקות חום, מעברי טמפרטורות • שינוי ריכוזים בסביבת הגידול • עקת חמצון • התדלדלות מקור פחמן, חנקן • גידול על מקור פחמן שונה • פאזה סטציונארית • ביקורות (תלוי בניסוי): • השוואה לתנאים אופטימליים • השוואה לזמן תחילת ניסוי

8. ESR – תגובה גלובלית • 2 צברים גדולים (F ו-P), הציגו תבניות ביטוי הפוכות בכיוונן אבל זהות בעוצמתן • הוגדרו כ-גנים של ESR – Environmental Stress Response • סה“כ כ-900 גנים, 14%~ מהגנום • ירידה בעוצמת ביטוי – כ-600 גנים • גדילה, עיבוד ומטבוליזם רנ“א, ביוסינטזה של נוקליאוטידים, תהליכים מטבוליים שונים • עלייה בעצמת ביטוי – כ-300 גנים • תיקון נזקי דנ“א, קיפול ופירוק חלבונים, דטוקסיפיקציה של תרכובות מחמצנות, תקשורת תוך תאית, מודיפיקציה של קרום התא

9. ESR upregulated • A – מטבוליזם של פחמימות • C – קיפול חלבונים • D – פירוק חלבונים • F – תקשורת תוך תאית

10. ESR - התאמה מהירה לתנאים החדשים • השינויים הגלובליים בכמות ה-mRNA היו לפרקי זמן קצרים • שינוי גדול בהתחלה, אך יש התאמה מהירה ל-steady state החדש, עם הבדלים קטנים לעומת ההתחלה • התאמה בין עוצמת העקה לעצמת התגובה A – הפרש טמפרטורות גדול B – הפרש טמפרטורות קטן יותר הקו האדום – הערך הממוצע של גנים שביטויים עלה הקו הירוק – הערך הממוצע של גנים שביטויים ירד

11. ספציפיות של ESR – ברמת הבקרה • צבר TRX2: • רמת ביטוי עולה כחלק מ-ESR • רמת ביטוי גבוהה בהרבה יחסית לשאר ה-ESR בעקות חימצון שונות • בקרה של צבר TRX2: • בעקת חימצון, מופעל ע“י אלמנט הבקרה yap1 • בעקת חום, מופעל ע“י אלמנט הבקרה msn2msn4 • הרבה צברי גנים מתבטאים ב-ESR, אך ברמת ביטוי גבוהה במיוחד בתנאים ספציפיים (למשל chaperons)

12. ספציפיות של ה-ESR – העדפה בין איזוזימים • איזוזימים – צורות שונות של אותו האנזים, בעל אותה הפונקציה באותו הפרט. • יש הבדל בעצמות הביטוי בין איזוזימים שונים • הבדלים בתכונות כגון ספיצפיות לסובסטרט, מיקום בתוך התא וכו'

13. מה מפעיל את ה-ESR? • בשל האופי הגלובלי של התופעה, ההשערה הייתה שכל שינוי בתנאי סביבה מפעיל את ה-ESR • ביצעו שינויי תנאים הפוכים וראו תוצאות הפוכות: • עקה – הפעלת ESR • חזרה לתנאים מועדפים – תגובה הפוכה, חזרה מהירה לרמת הביטוי של ה-steady state המועדף

14. סיכום ESR • מערכת גלובלית הרגישה להרעה בתנאי הגידול • מותאמת בעצמתה ובביטוי הגנים לעקה הספציפית • מרמזת על המערכות הפיזיולוגיות החיוניות לקיום, כגון: • שמירה על אנרגיה (דיכוי של מאות גנים הקשורים ברפליקציה וסינטזת חלבונים) • קיפול חלבונים תקין • הגנה מנזק חמצוני • תיקון דנ“א • Cross-Resistance–בתנאי עקה התא מתכונן לעקה כללית

15. Comprehensive Identification of Cell Cycle–regulated Genes of the Yeast Saccharomyces cerevisiae by Microarray HybridizationPaul T. Spellman, Gavin Sherlock, Michael Q. Zhang, Vishwanath R. Iyer, Kirk Anders, Michael B. Eisen, Patrick O. Brown, David Botstein, and Bruce Futcher מטרות: • לזהות ולאפיין גנים המבקרים את מחזור התא של השמר או הנמצאים תחת בקרה זו • בשמר ישנם גנים ידועים רבים המשפיעים על מחזור התא או המבוקרים על ידו, מה שיאפשר קיום ביקורת לתוצאות שיתקבלו

16. ביצוע הניסוי • ברצוננו לעקוב אחר ביטוי הגנים בתאים בהתאם לשלב בו הם נמצאים במחזור. לשם כך יש צורך לבצע סינכרוניזציה בין תאי התרבית – זאת נעשה ע"י עצירה זמנית של כל תאי התרבית בשלב מחזור מסוים. • כדי להימנע מתופעות לוואי שעלולות להשפיע על ביטוי הגנים ננקטו במערך הניסוי 3 שיטות שונות לסינכרוניזציה של התאים. תוצאה נוספת "יובאה" מניסוי אחר שבוצע באותה השנה. • כקבוצת ביקורת בכל אחד משלבי בניסוי שימשה תרבית שמרים שאינה מסונכרנת.

17. קבלת תוצאות • לאחר בדיקת דגימות מתאי התרביות בנקודות זמן שונות, בעזרת chips המכילים 6,200~ גנים ו-ORF, מתקבלות תוצאות במטריצה מתוכה אנו רוצים לאתר את הגנים שמתבטאים באופן מחזורי. • לשם כך: • בוצע נירמול לרמת ההופעה של ה-mRNA כך שהערך הממוצע של log(ratio) יתאפס. • נקבע מדד מיוחד המייצג את מידת המחזוריות שנמדדה לגן בהתאמה לזמן מחזור התא

18. קביעת רמת המחזוריות של גן • לצורך איתור הגנים המחזוריים מתוך כלל הגנום בשמר כלל המדד: • שימוש בטרנספורם פורייה להערכת המחזוריות של פונקצית הביטוי של כל גן. • השוואה בין הגנים לביטויים של חמישה גנים ידועים בעלי הופעה מחזורית ברורה. כ"א מהגנים אופייני לשלב אחר. • במדד זה טמונה הנחה על-פיה גן מחזורי מגיע לשיא ביטויו פעם בכל מחזור • לאחר חישוב ערך המדד (CDC score ) עבור כל אחד מהגנים יש צורך בקביעת הסף להכללה/אי הכללה של הגן כמחזורי.

19. קביעת ערך הסף • סיווג הגנים המחזוריים בוצע תוך כדי : • צרוף כמה שיותר גנים הידועים כמחזוריים. (104 בזמן הניסוי) • הרצון לצרך כמה שפחות גנים שידועים כלא מחזוריים. • בסופו של דבר ישנה שרירותיות מסוימת בקביעת זו. • ע"ס חישובים סטאטיסטיים המתבססים על רנדוניזציות שונות של מטריצת הביטוי , נצפה לאחוז של 10%-3% false positive.

20. גן מחזורי - דוגמא

21. הכללת מידע ממחקרים קודמים

22. גנים שסווגו כ-cell cycle regulated מסודרים לפי זמן הביטוי המקסימאלי • כתוצאה מאיתור הגנים וסידורם זה משויכים: • 300 ל-1G • 71 ל-S • 121 ל-2G • 195 ל-M • 113 ל-G/M

23. גנים המסווגים כ-cell cycle regulated לאחר clustering • בעקבות מיון זה נצפה כעת למצוא קשר הדוק יותר המשקף את פרופיל הביטוי של כל גן. • ואכן, נדגים בהמשך כי שיטת ה-clustering הזו שמה תחת אותו הצבר גנים בעלי דמיון פונקציונאלי.

24. Regulation-DNA binding sites • כ-70% מהגנים מראים תגובה משמעותית ל-cln3 או clb2 (ציקלינים) • בחיפוש ב- 700 הבסיסים upstream לקודון ההתחלה של 800 הגנים שאתרנו נמצא שלרוב הגנים ישנה התאמה גבוהה לפקטורי שעתוק מוכרים בהתאמה לזמן המופע המקסימאלי. • בנוסף, נמצא כי עצם קיום הרצף לפני הגן ואף מיקומו יחסית לקודון AUG יכולים להוות ניבוי טוב לקבוצה אליה הוא משתייך.

25. שכיחויות אתרי קשירה לפי פאקטורי שעתוק מוכרים • קבוצה C-279 גנים שידוע כי ביטויים אינו מחזורי • ציר ה-X מייצג את מרחק האתר שנמצא מקודון ההתחלה. • N-בסיס כלשהו ; Y-C/T ; W-A/T ; R-A/G ; M-A/C

26. רצף בקרה משולב • בדוגמא לעיל , זיהו בעקבות התהוות ה-cluster בן 35 הגנים. רצף קונצנסוס משוער שמשלב שני רצפים של אלמנטי-בקרה שנחשבו, עד כה , נפרדים. • Cluster זה , 2CLB, כולל בעיקר גנים המעורבים במיטוזה.

27. אפיון לצברים שנוצרו כתוצאה מה-clustering (דוגמאות) • 1G • 2СLN: • בקבוצה 76 גנים, רבים מהם מעורבים בשכפול DNA. שיא הביטוי באמצע 1G. • ב-58% מהם יש לפחות עותק אחד של הרצף ACGCGT (התאמה מושלמת לאלמנט MBC מול 6% בקבוצת הביקורת) • ב-52% מהם יש לפחות עותק אחד של הרצף CRCGAA (רצף מנוון לאלמנט SCB מול 13% בקבוצת הביקורת) • נמצאו מוטיבים מוכרים נוספים ואותר אחד חדש. • S+M • Histones • באים לביטוי בייחוד בשלב ה-S. מדובר בצבר קטן של 9 גנים בעלי התאמה גבוהה במיוחד בין אופי ביטויים. הפער בין נק' המקסימום למינימום גבוה מאוד. • גנים אלו מבוקרים בכמה רמות:אלמנטי בקרה שלילית, אלמנט באיזור ה-3' שמפחית את יציבות ה-mRNA למעט בשלב ה-S, אלמנטי בקרה חיוביים.

28. צברים שזוהו כשייכים לשלבי ה-S וה-M • A - היסטונים • B - MET • C - 2CLB

29. מבט כללי בתבנית ביטוי הגנים בהתאם לתפקידם: • גנים רבים מגיעים לביטוים ממש לפני השלב בו הם נדרשים. תופעה זו בולטת בייחוד בגנים הדרושים ל-replication, ותיקון DNA. • בגנים כדוגמת ההיסטונים, רואים שהביטוי המקסימאלי מתרחש בשלב עצמו. • במקרים אחרים, כדוגמת תחילת השכפול, רק הטריגר הדרוש לתהליך מופיע בנק' הזמן המתאימה.

30. שיוך גנים לפי פונקציה ושלב ההופעה

31. שיוך גנים לפי פונקציה ושלב ההופעה

32. אמינות התוצאות • המאמר בו אנו עוסקים הוא אחד מהראשונים שעסקו ב-clustering לגנים מחזוריים וככזה, נבחנה במיוחד אמינות התוצאות שהתקבלו. • זיהוי הגנים כמחזוריים נעשה, בסופו של דבר, ע"י קביעת סף שרירותית. ובבדיקה ביחס לגנים שהיו ידועים מראש כמחזוריים נמצא כי 9 מתוך 104 לא נכללו ברשימה. • בהשוואה למחקר דומה (Cho et al. (1998)) אחר שנערך במקביל וכלל ג"כ תוצאות של קריאת microarrays, נעשתה עבודת איתור הגנים המחזוריים באופן ידני. בהשוואת התוצאות של שני המחקרים נתגלה חוסר חפיפה מסוים :

33. המחקר של cho זיהה 421 גנים מחזוריים (בהשוואה ל-800 במחקר זה) ובהשוואה בין הקבוצות רק 304 סומנו בשני המחקרים. • כמה הסברים אפשריים לתוצאות אלו: • הגדרת גן מחזורי אינה הגדרה חד-משמעית. • “noise” בחלק מהתוצאות יכול להסביר תוצאות שגויות בשני הכיוונים (false positive & negative). • במחקר שנערך ע"י cho נעשה שימוש במעכב אחד בעוד שבפרוש רואים במחקר של spellman מספר תוצאות שנתגלו במעכב אחד אך לא באחר. • במציאת הגנים המחזוריים הונח מראש כי גן בעל בקרה מחזורית מגיע לשיא ביטויו רק פעם במחזור- הנחה שאינה, בהכרח, נכונה. • האלגוריתם שנבחר למציאת המחזוריות אינו האופטימלי.

34. בבחינת רצפי הבקרה, הצליחו החוקרים לזהות , אלמנטי בקרה המשוייכים לגנים מבוקרים מחזורית בכ-500 גנים. דבר המשאיר כ- 300 גנים נוספים מבלי שזוהה האלמנט המבקר אותם. מספר סיבות אפשריות לכך: • מספר אלמנטי בקרה שעדיין לא זוהו. • קבוצה זו של 300~ גנים מאופיינת ברמת מחזוריות נמוכה יחסית ליתר. ייתכן שאלמנטי הבקרה בקבוצה זו מנוונים. • ייתכן שבמקרים אלו הבקרה ברמה אחרת – לדוגמא יציבות ה-mRNA.

35. סיכום Cell Cycle Regulated Genes • נמצאו 800 גנים המבוקרים בתיאום עם מחזור התא • נמצאו צברים פונקציונלים של גנים המעורבים במחזור התא • היסטונים • CLN2 • MET • צברים רבים נמצאו תחת השפעה של אלמנטי בקרה ידועים • התקבל מידע על זמני ההפעלה הספציפיים של רצפי הבקרה • נמצא רצף בקרה משולב חדש • נקבע פרופיל הביטוי של קבוצות גנים רבים לאורך מחזור התא

36. אז מה ניתן ללמוד מ-clustering? • השיטה מאפשרת • עיבוד נתונים מהיר בקנה מידה נרחב • הסקת מסקנות בעלות משמעות ביולוגית • הצגת המסקנות בצורה ויזואלית נוחה • מה סוג המסקנות שניתן להסיק? • פרופיל ביטוי דומה מרמז על נוכחות בקרה משותפת • ניתן לאפיין גנים לא ידועים הנמצאים בצברים מאופיינים היטב • ניתן ללמוד על ה"התנהגות" הפיסיולוגית הכללית של התא מפרופילי הביטוי של קבוצות פונקציונליות ידועות • ניתן ללמוד על אופי ההשפעה או הנזק שנגרם לתא על סמך צברי הגנים שהופעלו בו כתגובה