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TOCSY

生物大分子波谱学原理 吴季辉. TOCSY. 全相关谱 TOCSY(total correlation spectroscopy) 也称 HOHAHA (homonuclear Hartmann-Hahn spectroscopy) ， 可以提供 整个自旋体系的信息 。. 生物大分子波谱学原理 吴季辉. TOCSY. TOCSY. MLEV-17. Spin Lock. Product Operator:. Positive and absorptive diagonal & cross peaks for Z-filtered anisotropic TOCSY.

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Presentation Transcript

  1. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY 全相关谱TOCSY(total correlation spectroscopy)也称HOHAHA (homonuclear Hartmann-Hahn spectroscopy)，可以提供整个自旋体系的信息。

  2. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY

  3. TOCSY MLEV-17 Spin Lock Product Operator: Positive and absorptive diagonal & cross peaks for Z-filtered anisotropic TOCSY

  4. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY

  5. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY 在TOCSY中用的混合脉冲有很多种类，如WALTZ-16,MLEV-17,DIPSI-2,DIPSI-3等，不同的isotropic mixing sequence的效率不同，适合的谱宽也不同。 在混合脉冲期间还有ROE效应，因此有的TOCSY序列中的混合脉冲包括一定的间隔，在无脉冲的间隔中没有ROE效应，但有NOE效应，由于蛋白质等大分子有ROE＝－2NOE，这样适当选取间隔长度，可使二者基本抵销。这种TOCSY序列称为Clean-TOCSY。

  6. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY • C 实验及处理 • 同相谱与COSY等反相谱不同，间接维的点数不必很大，一般512点足够。 • 混合时间的选择与要求的传递距离有关，传递距离越长，需要的时间越长，一般短的可取20-30ms，长的可取100ms左右。要注意：混合脉冲所用的功率不能太大，尤其混合时间较长的。否则可能损坏放大器及探头，另外混合脉冲产生的热量将使样品发热，使得TOCSY的峰位同其他谱相比发生位移。 • 由于TOCSY是同相谱，一般用相移60－90度的正弦窗函数。

  7. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY

  8. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY D 应用 TOCSY可提供整个自旋体系的连接，而且信号强，对于谱峰证认很有用。

  9. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY-wagergate 预饱和， 低功率选择性90脉冲（对准水峰）

  10. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY-doublewagergate d1恢复前梯度脉冲清除残留磁化，两个WATERGATE以改善基线

  11. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 TOCSY-enhance mode 180度脉冲

  12. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 第六章同核核磁实验方法 COSY型实验 多量子谱 TOCSY NOESY ROESY

  13. Selection of NOESY and ROESY ~1000 ~3000

  14. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY

  15. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY

  16. NOESY Mixing time: ~80% of T1

  17. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY

  18. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY

  19. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY

  20. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY C 实验及处理 同TOCSY类似，间接维的点数不必很大，但考虑到NOESY积分的要求，最好稍为大一些，一般取512－800点。累加次数也要大一些，以获得信噪比较好的谱。 混合时间的选择很重要，从上述传递效率的关系式可知，在一定范围内，混合时间小，交叉峰弱，混合时间越长，交叉峰越强。混合时间长到一定程度，交叉峰反而变弱，称为出现了自旋扩散。只有在前者情况下（initial rate regime），交叉峰强度才与混合时间以及两核间的交叉弛豫速率成正比，即此时的交叉峰强度与两核间的距离的6次方成反比，这里假定适用各向同性的运动翻滚模型。 一般由NOESY计算距离约束有两类方法：一种用已知距离的交叉峰积分为基准，根据交叉峰强度与两核间的距离的6次方成反比的性质，来推算其他交叉峰对应的距离，这时混合时间应该在initial rate regime范围内，以免自旋扩散的影响；另一类直接利用交叉峰强度与弛豫矩阵的指数的关系，通过所谓的完全弛豫矩阵迭代来计算弛豫速率以及对应的空间距离，这时混合时间可以长一些，因为自旋扩散的影响已经包括在弛豫矩阵的指数函数中。一般在蛋白质结构计算中常用第一种方法，而在核酸结构计算中常用第二种方法。 通常小蛋白质的NOESY的混合时间可以取得相对大一些，大蛋白质运动慢，更容易产生自旋扩散，最大可取到100多ms。

  21. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY 零量子峰的强度受混合时间的余弦调制，所以混合时间大，交叉峰强时，零量子峰的干扰就小，因此一般尽可能取大一些的混合时间。混合时间小时，应当采取一定措施抑制零量子峰，有若干不同的方案，基本上均利用零量子峰的强度受混合时间的余弦调制这个性质。如混合时间在一定范围内变化，累加所有结果；或者在m期间插入一个180度脉冲，此时纵向磁化仅仅变号，而零量子项的有效进动时间与180度脉冲的位置有关，若180度脉冲的位置随t1随机变化，也可抑制零量子峰。 由于NOESY是同相谱，一般用相移60－90度的正弦窗函数。

  22. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY D 应用及其他 原则上，距离小于5埃的两个氢核都能产生可观测的NOE交叉峰。NOESY既用于序列证认，也用于获得距离约束。水峰预饱和往往抑制水峰附近的信号，也使相关的交叉峰强度变化，这时可采用其他手段，如jump-and-return，或用WATERGATE梯度场脉冲作为观测序列。

  23. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY

  24. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY

  25. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 NOESY

  26. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 第六章同核核磁实验方法 COSY型实验 多量子谱 TOCSY NOESY ROESY

  27. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 ROESY 由于实验室坐标系中的交叉弛豫速率在小分子为正，在大分子为负，在中间大小的分子如小肽接近零，因此小肽的NOE交叉峰非常弱乃至消失。在这种情况下要得到残基间的关联信息可以利用ROESY实验。ROESY实验检测旋转坐标系中的交叉弛豫速率，同NOE不同，ROE在所有相关时间下均为正，因此即使NOE峰消失，ROE峰仍能产生。

  28. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 ROESY

  29. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 ROESY

  30. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 ROESY

  31. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 ROESY

  32. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 ROESY C 实验及处理 由于自旋锁定期间会产生TOCSY型的信号传递，射频场功率要相当低，一般取2-5kHz，一方面为了抑制TOCSY型峰，另一方面为了避免样品发热及保护仪器，因为ROESY混合时间较TOCSY长。 同NOESY相比，混合时间可以短一些，因ROE速率为NOE速率的二倍。 采样点数及适用的窗函数等与NOESY类似。

  33. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 ROESY D 应用 主要用于分子量较小的多肽，较大蛋白质的其他研究也可用ROESY，因自旋扩散对ROESY的影响相对小一些，此外在ROESY中交叉弛豫产生的交叉峰为负峰，而化学交换产生的交叉峰呈正峰，因而可用于相关的研究，其他一些类似的旋转坐标系中的核磁实验可用于研究蛋白质分子的整体运动。 但在定量上，这类实验受频偏及其他因素的影响较大。

  34. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核相关谱谱形总结 以下列出本节讨论过的所有 (AX体系) 同核化学位移相关谱的谱形。虽然每组共振峰都有4个峰，但往往只有在DQF-COSY谱中能看到4个峰。对于本节已讨论过的其它几个2D谱，如幅度COSY，TOCSY，NOESY和ROESY，由于分辩率较低，这4个共振峰往往合并成一个峰。 幅度COSY由于是幅度谱，因而是纯吸收的正峰，不过其共振峰较相敏谱的来得粗一些，不能调相。

  35. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核相关谱谱形总结 幅度COSY由于是幅度谱，因而是纯吸收的正峰，不过其共振峰较相敏谱的来得粗一些，不能调相。 对于相敏COSY和DQF-COSY，由于是通过反相分量产生相干转移而建立起核与核之间的联系 (由交叉峰表现)的，因此其交叉峰是正、负交替的。 对于由反相分量而建立起的联系的谱，如幅度COSY，相敏COSY，DQF-COSY都是用正弦钟窗函数进行处理，以便加强交叉峰，削弱对角峰。

  36. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核相关谱谱形总结 对于TOCSY，NOESY和ROESY由于是通过同相分量而建立起核与核之间的联系的，因此其交叉峰是同相的。 对于由同相分量而建立起联系的谱，如TOCSY，NOESY和ROESY都用余弦窗函数进行处理，以便加强交叉峰而削弱对角峰。

  37. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核相关谱实验设置 同核相关实验的设置如下： 幅度COSY：采集256个FID, 零填充后谱由1K1K个实数点组成； 相敏COSY：采集512个FID, 零填充后谱由2K2K个实数点组成； DQF-COSY：采集512个FID, 零填充后谱由2K2K个实数点组成； TOCSY : 采集256个FID, 零填充后谱由1K1K个实数点组成，=15ms75ms； NOESY ：采集256个FID, 零填充后谱由1K1K个实数点组成, =150ms250ms； ROESY ：采集256个FID, 零填充后谱由1K1K个实数点组成，=150ms250ms； 以上数据适合于分子量小于10000的分子的实验。从中可看出，由于相敏COSY和DQF-COSY的交叉峰是反相的，为了防止正负对消，因而所用数据集较大。

  38. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核相关谱实验设置 在进行这些2D实验时，接收机的增益 (receiver gain) 的设置值得注意。对于这三种COSY实验（幅度COSY，相敏COSY，DQF-COSY），由于它们的FID信号是调制的。因次，前面的一些FID的信号会很弱，第一个FID（t1=0）的信号强度为零。但会逐步增强。所以接收机增益的设置不能由前面的FID来确定，而只能由后面的FID来确定，否则会由于接收机增益太大而导致出现许多假峰。但对于TOCSY，NOESY和ROESY实验，由于它们的FID是调制的，因此第一个FID具有最强的信号强度。于是这三个实验的增益可由它们的第一个FID的强度来确定。

  39. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核相关谱实验设置 在实验中，NH-H交叉峰有可能缺失，导致NH-H交叉峰缺失的原因和相应的解决方法如下： 1. 由于水峰的饱和导致水峰附近的H共振峰的饱和或部分饱和而引起NH-H交叉峰缺失。这时可升高或降低温度10C, 这时水峰移动显著，而H共振峰基本上不变； 2. 由于NH与H2O存在交换，当水峰饱和时，导致NH共振峰部分饱和因而其强度下降。这可通过改变压水峰方法 (如改用或等)，降低温度和pH使交换变慢而避免； 3. 由于小的NH-H耦合常数或大的线宽导致的反相信号的对消而导致的交叉峰缺失。这可通过降低样品的粘度 (如降低样品浓度或升高温度) 而减小线宽。

  40. 生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核三维谱 从二维谱到三维谱的扩展是很自然的，因其有助于拥挤谱峰的解析。最初进行的三维谱为同核三维谱。 同核三维谱相对于异核三维谱有很多不利之处：因为氢谱谱峰数目多，加上重迭严重，要求的采样点数多，这样的三维谱数据量大，采样时间长；氢核间的J偶合常数不大，相干传递所需时间长，可能由于弛豫衰减而无法实现；同核三维谱的谱峰数目较二维谱明显增多，谱峰解析困难；由于没有用到异核的信息，往往不足以解决谱峰重迭的问题，在谱峰归属及序列证认方法上也不如异核三维谱。一般将NOESY同TOCSY串接起来。

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