实验 103 对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析

1. 实验103 对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析 103.1 实验目的 (1) 了解高效液相色谱仪构造。 (2) 了解高效液相色谱分析操作。 (3) 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量方法。

2. 103.2 实验原理 对羟基苯甲酸酯类混合物中含有强极性化合物对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。 由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类备组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。

3. 本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析法相同。而对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，可用下式：

4. 四只100 mL容量瓶 配制浓度均为1000 μg·mL-1的上述四种酯类化合物的甲醇溶液 配制浓度均为10μg·mL-1的 四种酯类化合物的甲醇溶液 上述四种 标准贮备液 四只10 mL容量瓶 103.3 实验条件 溶液的配制 (1)标准贮备液： (2)标准操作液： (3)未知样品 混匀 备用

5. 色谱条件： 长25 cm、内径3 mm 装填C-18烷基键合相 粒度为10 μm的固定相 (1)色谱柱 甲醇︰水=55︰45流量 1 mL·min-1 (2)流动相 紫外光度检测器检测波长254 nm (3)检测器 (4)记录仪 量程5 mV 走纸速度480 mm/h 3 μL (5)进样量

6. 1. 置于 配制好的流动 相甲醇水溶液 脱气15 min 超声波发生器 2. 根据实验条件 仪器 调节至进样状态 按照仪器的操作步骤 待仪器达到平衡时 记录仪基线呈直线 3. 依次分别吸取3 μL的四种标准操作液和未知试液进样 记录各色谱图 103.4 实验步骤 即可进样

7. 103.5 实验数据记录与处理 1．记录实验条件 2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物标准溶液色谱峰的保留时间tR，并填于下表中：

8. 3．测量未知试样色谱图上各组分的峰高h，半峰宽Y1/2，计算各组分的峰面积A及其含量wi，并将数据列于下表中：3．测量未知试样色谱图上各组分的峰高h，半峰宽Y1/2，计算各组分的峰面积A及其含量wi，并将数据列于下表中：

9. 103.6 注意事项 • （1）严格按照规定使用仪器，防止因错误操作造成仪器损坏。 • （2）流动相使用前应用微滤膜过滤并充分脱气。 • （3）样品溶液若不清澈透明，应用微滤膜过滤。 • （4）实验结束后，应冲洗色谱柱30 min以上。

10. 103.7 问题讨论 • （1）色谱定量分析采用归一化法定量有何优缺点?本实验为什么可以不用相对质量校正因子? • （2）本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。 • （3）高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱气对实验有何妨碍？

11. 103.8 参考答案 • （1）色谱定量分析采用归一化法定量有何优缺点?本实验为什么可以不用相对质量校正因子? • 答：归一化法的优点是：简便、准确，当操作条件如进样量、流速等变化时，对结果影响小。但若试样中的组分不能全部出峰，则不能应用此法。本实验样品为同系物，若各组分的相对校正因子值相近，所以可以略去。

12. （2）本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。（2）本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。 • 答：流动相极性大于固定相极性的色谱称为反相色谱，反之称为正相色谱。本实验所用样品均为极性化合物，依据“相似相溶”原则，宜选用极性固定相、非极性的流动相，即选择正相色谱。但是，高效液相色谱的可贵之处是它的分离效能很高，对于极性化合物往往用反相色谱也能实现很好的分离，而且，反相色谱的流动相通常使用甲醇和水，价格远低于正相色谱通常使用的正己烷。

13. （3）高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱气对实验有何妨碍？（3）高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱气对实验有何妨碍？ • 答：流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作；另外，如果在检测器中产生气泡，会造成基线波动或异常出峰。