全细胞生物催化剂用于生物柴油生产

1. 全细胞生物催化剂用于生物柴油生产 孙严杰

2. 生物柴油及生产简介 • 生物柴油燃料主要成分是烷基脂肪酸酯。 • 酶促酯交换提供了相当大的优势,包括减少在生物柴油生产操作和一个简化分离甘油副产品的过程。 • 它的主要障碍是脂肪酶的成本高，为了减少酶相关的处理成本，工业应用生产全细胞生物催化剂，将真菌菌丝在生物质支持颗粒里固定以及脂肪酶在酵母细胞表面表达已经开发出来。

3. Fig. 1. Transesterification reaction

4. 碱催化生产生物柴油流程图

6. introduction • 严峻的现实使生物柴油得以发展。 • 利用甘油三酯作为替代燃料的柴油，但不可直接使用，需加工，例如将单、双、三甘油酰酯化合物转换为甲基酯，其中水分，游离脂肪酸，游离甘油和总甘油残留醇等成分也需要控制。 • 碱催化酯交换的优缺点； 优点：高的转换率；反应时间短， 缺点：耗能大；副产品甘油回收困难；移除碱催化剂和处理废水工序复杂成本高。 • 酶催化酯交换反应比碱催化有很大优势最主要的有时是分离甘油不要复杂的步骤。

7. 其中固定化酶酯交换反应 既将脂肪酶固定在丙烯酸树脂上，实验表明可以提供更好的转换率且易于回收。但成本高，利用微生物如细菌，酵母菌和真菌作为全细胞生物催化剂可适当降低成本 • 丝状真菌分批培养可自发的固定在BSPs（生物质支持颗粒）上制成聚氨酯泡沫，这样可在转化过程中能反复使用。 • 且重组丝状真菌作为高效全细胞生物催化剂把它固定在BSPs上的潜能，可大大促进在水和非水介质中催化。 • 本文主要讲述植物油的酶促酯交换同时阐述了全细胞生物催化剂的机制最新进展。

8. 一、酶促交换反应 • 利用细胞外或细胞内脂肪酶作为催化剂生产生物柴油燃料以减轻碱催化的相关问题。（如耗能大；副产品甘油回收困难）Shimada 等人报道说将Novozym435固定在丙烯酸树脂是最有效的酯交换反应催化酶。（酶活性保持了50个反应周期。 • Kaieda 等人发现大豆油的酯化反应在无配向性和1、3配向性脂肪酶在水系统中无需使用任何有机溶剂。其中非特异性脂肪酶Candida. Rugosa、Pseudomonas.cepacia and Pseudomonas.荧光显示它们有相对较高的转换率。其中当使用1、3配向性脂肪酶甲酯含量高于80%并高于理论值。合理解释是用薄层层吸知道ROL（配向性脂肪酶）只作用在乙酰基的1和3位点。在水系统中部分甘油三酯的原始乙酰基自发从2位点迁移到1，3位点。 • 此外，酶催化生成的燃料的性能，例如粘度、十六烷值、闪点等都对酶促反应有很大的影响。

9. 二、全细胞生物催化剂 • 概念：全细胞生物催化是指利用完整的生物有机体（即全细胞、组织甚至个体）作为催化剂进行化学转化的过程，这种反应过程又称为生物转化。生物催化中常用的有机体主要是微生物（如细菌、酵母、丝状真菌等），其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化，常用的催化方式是将细胞固定于反应平面、微球体悬浮、多孔固相载体等方式。

10. 采用了不同的全细胞生物催化剂生产生物柴油

11. 三、真菌全细胞生物催化剂 • Ban等人将菌丝固定在用聚氨酯泡沫制成的生物质支持颗粒里（BSPs），作为全细胞生物催化剂生产生物柴油。他们研究了细胞内脂肪酶生产的最佳培养条件，前处理方法的影响，和水含量对甲醇分解作用的影响。 • 此外基质的组成对酶活性有很大的影响。通过应用免疫荧光染色法对脂肪酶标记，可显示在不同基质中酶活性的强弱，Teng 等人研究发现，橄榄油是R. chinensis全细胞生物催化剂最好的脂肪酶活性基质。 • 使用全细胞生物催化剂的优势在于在无水或非传统介质中培养可增强全细胞生物催化剂在反复使用中的稳定性。

12. 微生物R.oryzae用免疫荧光染色法对脂肪酶标记。在每个小组图片左边显示微分干涉差显微镜，荧光显微镜显示在右侧。细胞没有橄榄油的培养显示为a。b为有橄榄油的细胞培养更多脂酶活性体现在更高的荧光信号。微生物R.oryzae用免疫荧光染色法对脂肪酶标记。在每个小组图片左边显示微分干涉差显微镜，荧光显微镜显示在右侧。细胞没有橄榄油的培养显示为a。b为有橄榄油的细胞培养更多脂酶活性体现在更高的荧光信号。

13. 四、全细胞生物催化剂稳定性 • Oda等人报道说全细胞生物催化剂的耐用性取决于培养方式。细胞培养的在(air-lift)气升式生物反应器具有较高的ME产量比那些从摇瓶获得的，并且他们的转换率可维持多次重复。 • 经戊二醛（gluteraldehyde）交联处理膜上结合酶，酶活性可保持很多循环，而在细胞内因不能进行戊二醛（gluteraldehyde）处理，脂肪酶活性经很短的几个周期大大降低。 • 当菌丝体被用yatalase（一种酶）处理，它是一种可部分降解真菌细胞壁的酶，暴露出来的膜结合酶和底物结合从而提高其活动。

14. 五、全细胞生物催化剂的脂肪酸膜组成 • 一些研究显示脂肪酸影响质膜的性能，通过实验显示脂肪酸的组成显著影响膜的渗透性。 • 细胞富含丰富的油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸中具有较高的初始甲醇分解活性。脂肪酸组成增加细胞膜的通透性和刚度并且这种高渗透性和刚度被认为会导致增加甲醇分解活性活动和酶稳定性。通过实验确定了最佳的细胞膜组成油酸和棕榈酸的混合比例为0.67具最高的甲醇分解作用和更好的稳定性。 • Rf值=油酸/ （油酸+棕榈酸）w/w)

15. 六、全细胞生物催化剂的分泌机制和脂肪酶的定位六、全细胞生物催化剂的分泌机制和脂肪酶的定位 • Hama 等人通过Western印迹分析R.oryzae脂肪酶定位。在悬浮液培养，会产生少许脂肪酶，大部分膜结合酶将大量减少。相比之下，在固定培养中，真菌菌丝体被固定到BSPs内这样大量脂肪酶被保留在细胞内。 • 进一步研究显示ROL34的N -末端28 -氨基酸残基是至关重要的，以决定脂肪酸酶的定位。 • 大多数ROL31发现位于细胞膜和细胞内的甲醇分解作用的酶的活性有密切的关系。这些结果表明，试图增加ROL31的膜固定可能会导致更高的酶活性。

16. R.Oryzae细胞主要生产两种类型的脂肪酶分子量为34和31 kDa。 正如图所示， 34 kDa的脂肪酶（ROL34)被束缚在细胞壁上， 而31 - kDa的脂肪酶（ ROL31）被固定在膜上。

17. 七、不可食用油作为潜在的基质 • 生物柴油生产的主要成本是相关基质油的费用。 • Tamalampudi等人是第一次利用已被固定到BSPs上的R.Oryzae的全细胞生物催化醇解麻风油。发现全细胞催化剂优于商业酶Novozym 435 。这些结果表明，用全细胞生物催化剂可避免昂贵的下游加工步骤。 • 微藻甘油三酯也引起关注,作为潜在经济的基质用于生产生物柴油。用它们有两个好处，他们的生长代谢可利用掉温室气体，同时促进甘油三酯的积累，达他们干重的80 ％以上。因此，进一步研究，结合全细胞生物催化生产藻类甘油三酯可能生产工业可行和环境友好的生物柴油生产过程。

18. 八、酵母作为全细胞生物催化剂 • 在微生物细胞表面所显示的外源蛋白已被广泛用于各种生物转化过程。如右图R.oryzae脂肪酶基于FLO1基因这个基因编码了一个凝集素样的细胞壁蛋白。Flo1p是由多个域组成。在ROL的N端有一个蛋白质序列被融合的FLO1p絮凝功能域。利用酵母细胞表达酶的活性。不需要任何预处理，就可进行酯化反应。脂肪酶通过基因工程在细胞的表面的以表达具有高度成本效益，并能够方便的回收全细胞生物催化剂，采用表面表达脂肪酶的一个主要优点是再醇解时他们很容易进入基质中。

19. 九、工程大肠杆菌的全细胞生物催化剂 • Kalcheur等人，提出脂肪酸乙基酯的从头合成生产生物柴油。在有氧条件下用葡萄糖和油酸培养工程大肠杆菌，此菌可表达丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶和非特异性转移酶。经发酵生成乙醇然后在非特异性转移酶的作用下和油酸结合生成脂肪酸乙基酯。

20. 十、对比分析固定化脂肪酶和全细胞催化剂 • 全细胞生物催化和酶法相比，一个显著的区别是全细胞生物催化剂相对较低的反应速率（可通过使用全细胞生物催化剂的反应器填料塔），可缩短获得最高甲基酯的转换的时间，W. Li等人另一份研究报告表明，全细胞生物催化剂在(t-butanol)叔丁醇系统的应用。这种方法不仅减少了反应时间，同时增加了全细胞生物催化剂在重复分批反应体系运行的稳定性。

21. 十一、结束语和未来前景 • 全细胞生物催化可以提供比传统酶法工艺更好的优势，它提供一种廉价的催化剂制备方法和良好的操作稳定性。进一步提高全细胞催化生产生物柴油反应速率，对实际工业应用价值是必要的。 • 至今大多数研究执行的重点是甲酯的转换和较小程度在的酶和全细胞介导的酯交换反应的下游过程上，将来的工作也将是用酶法或全细胞催化解决甲酯燃料性能。此外酶促酯交换后仍保留相当数量的单甘油酯和多甘油酯。这些用单甘油酯和多甘油酯脂肪酶可以进一步转化为甲酯。 • 目前还正在研究发展具有潜力的经济的基质，例如微藻甘油三酯。