精子密度检测

1. ＜一个精子为“密” ＝一个精子为“中” ＞一个精子为“稀” 估 测 法 主观性强，误差大 精子密度仪法 和CASA 法 方便、时间短、重复性好 原精液200μL 3%NaCl稀释10倍 血细胞计数法 计数板上放盖玻片 最准确，但速度慢 滴上1滴稀释精液 计数5个中方格精子 猪精子密度一般为2~3亿/ml 生产上主要以精子密度仪法检测 将该数乘以50万 精子密度检测

2. 相差显微镜直接观察 伊红或姬姆萨等染色后普通显微镜观察 固定液固定20min 置1000倍油镜下 取中层精液抹片 Giemsa染色90min 水洗并风干 观察精子＞ 300个 畸形率检查方法 染色后显微镜观查 要求：一般要求不超过18%为宜 畸形率要求 精子畸形率检测 影响：畸形率过高会减少精液的受精能力 改善：增加精液的用量可以提高其受精效果

3. 1 精子质膜作用及分布 2 精子质膜染料分类 3 精子不同区域质膜的检测 4 目前主要的精子质膜检测方法 精子质膜完整性检测

4. 维持完整的 细胞内环境 作用 受精过程中起到信 号识别与传导作用 转运物质功能 精子 质膜 覆盖于顶体外 膜区上的质膜 分布 覆盖于精子头部 非顶体区的质膜 精子质膜作用及分布 覆盖于尾部的中段 和主段部分的质膜

5. 精子质膜染料分类 伊红—苯胺黑染色 非荧光染料 质膜染料分类 伊红—苯胺蓝染色 苔盼兰—吉姆萨染色 荧光染料 死精子特异性荧光染料 活精子特异性荧光染料 染色原理：此种染料不能进入质膜完整功能的精子内部，只能进入质膜受损的精子，并与DNA结合发出荧光。 染色原理：活精子特异的荧光染料是膜通透性的染料，只能进入细胞膜完整的精子。 • 碘化丙锭（PI） • Hoechst33258 • 溴化乙锭（EB） • 溴乙啡锭二聚体（EthD-1） • Yo-Pro-1 • Hoechst33342 • SYBR-14 • 羧基荧光素双醋酸盐 (CFDA) • 羧基二甲基荧光素双醋酸盐(CMFDA) • Carboxy-SNARF-1 • SYTO-17

6. 通常与顶体外膜完整性的检测联合起来进行 覆盖于顶体外 膜区上的质膜 荧光染料，例如碘化丙锭（PI）、溴化乙锭（EB）、DAPI、Hoechst 33258等 原理：低渗溶液中，有生物活性的精子质膜会使水分子进入质膜中，直到精子内外环境达到平衡为止。水的内流使精子尾部的质膜膨胀并且尾部会发生弯曲。但是精子质膜损伤或失去生物活性，水能够自由通过质膜，在胞质内不会积聚液体从而不会出现肿胀和尾部弯曲。通过相差显微镜可以观测到精子质膜对低渗液的反应。 覆盖于精子头部 非顶体区的质膜 非荧光染料，例如伊红—苯胺黑染色、伊红—苯胺蓝染色等 精子的低渗肿胀实验（HOST）检测 覆盖于尾部的中段 和主段部分的质膜 精子不同区域质膜的检测

7. 利用流式细胞仪检测 利用显微镜进行检测 Ａ Ｂ Ｃ • 红箭头所指区域为被PI • 　染色的死精子； • 蓝箭头所指区域为被 • SYBR-14染色活精子； Ａ：被PI染色的死精子，为红色； Ｂ：被SYBR-14染色活精子，为绿色，膜功能完整； Ｃ：被SYBR-14／PI染色，绿色为膜完整的活精子， 　　红色为死精子。 精子质膜检测方法

8. 1 检测线粒体的染料分类 2 精子线粒体检测方法 线粒体功能检测

9. 优缺点 染料名称 染色特性 R123 （Rhodamine123） 能渗透并沉积在正常线粒体上发出绿色荧光。如果线粒体损坏则不发绿色荧光。 在精子头部和尾部有非特异性染色，可检测线粒体有无功能，不能区别膜电位高低。 MITO （MitoTracker Green FM） MITO 在水溶液中不发荧光，而当积聚在线粒体内时会发绿色荧光。 MITO在精子头部有非特异性染色。 JC-1 （5,5',6,6'-tetrachloro-1,1 ',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine iodide） 线粒体膜电位低时，发绿色荧光；膜电位高时发橙色荧光 J C-1 染色的特异性最好，仅在线粒体部位发黄色或绿色荧光。 检测线粒体的染料分类 精子运动能力与线粒体的活性密切相关，整个精子代谢所需的能量主要由线粒体提供

10. 荧光显微镜检测： a：R123染色，在精子头部和尾部有非特异性染色，可检测线粒体有无功能，不能区别膜电位高低。 b：J C-1 染色，其特异性最好，仅在线粒体部位发黄色或绿色荧光。 c： MITO染色，在精子头部有非特异性染色。 • 检测方法： • 荧光显微镜 • 流式细胞仪 最适合的荧光染料：J C-1 流式细胞仪检测： A：R123/PI染色，箭头指发绿色荧光精子； B：J C-1 /PI染色，顶端箭头指发橙色荧光精子；底端箭头指发绿色荧光精子； C：MITO /PI染色，箭头指发绿色荧光精子； A-C，未被箭头标记的精子属于死精子，被PI标记。 A B C 精子线粒体检测方法

11. 精子膜的获能状态的改变很容易引起顶体反应的提前发生，以及精子受精能力的丧失精子膜的获能状态的改变很容易引起顶体反应的提前发生，以及精子受精能力的丧失 一 获能检测 顶体反应是精子成功穿入卵母细胞所必需的过程。 顶体内富含多种蛋白水解酶（顶体酶），在精子穿过卵子放射冠、透明带等受精过程中发挥主要作用。 二 顶体检测 获能和顶体检测

12. ① F型，整个精子头部有均一荧光，为未获能，顶体完整的精子； ② B型，精子头部顶体后区，在靠近尾部的部分无荧光或非常弱的荧光，而头前部为均一荧光，为获能且顶体完整的精子； ③ AR型，整个精子头部无荧光或非常弱的荧光，为顶体不完整的精子，即发生了顶体反应的精子或顶体缺损的精子。 采用金霉素（ CTC）进行获能检测 CTC 进入精子可以结合游离的钙离子，这些CTC-Ca2+复合物能够结合在质膜的疏水区并且在荧光显微镜下激发出黄绿色荧光 获能检测 ① ③ ②

13. 流式细胞仪检测精子的活力和顶体状态 • 荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态 A) B) C) • 绿箭头所指区域属于PI 标记精子，为死精子； • 蓝箭头所指代表FITC-PNA 标记精子，为顶体反应精子； • 黑箭头所指代表未发生顶体反应活精子。 • H33342 标记所有精子细胞核呈现蓝色荧光； • PI标记死精子的细胞核呈现红色荧光； • 发生顶体反应或顶体膜破损的精子被FITC-PNA 标记,呈现绿色顶体。 顶体检测

14. 原理： DNA 的变性位点具有感光性，用异源性的染料AO 染色，在荧光的激发下，插入没变性的双链DNA 的AO 染料发绿色荧光，而与变性的单链DNA 结合的AO 染料发红色荧光。 吖啶橙（AO）染色，进行染色质结构试验（SCSA） 插入没变性的双链DNA 的AO 染料发绿色荧光； 与变性的单链DNA 结合的AO 染料发红色荧光； 黄色跟橙色为正在变性的DNA。 １ １ １ １ ３ ３ ３ ３ ２ ２ ２ ２ 染色质完整性检测

15. 检测方法 • 目前检测精子结合透明带能力有两种方法： • 透明带结合检测（ZBA） • 半透明带检测（HZA） 卵母细胞与精子共同培养，然后使用相差显微镜或者荧光显微镜计算结合到透明带上的精子数量 ZBA 利用显微操作方法将卵母细胞切割两半，并去掉细胞质。然后两半透明带分别与对照组和实验组的精液样本孵育，最后使用相差显微镜计算结合的精子数量 HZA 透明带结合检测

16. 卵母细胞体外受精(IVF) 技术已经很成熟， 可以利用IVF技术来检测精子的受精能力。 优点 缺点 • 更能够接近体 • 内的受精过程 • 更好的检测精 • 子的真实质量 • 部分动物体外受 • 精技术并不成熟 • 费时费力 • 实验条件复杂 • 成本过高 体外受精检测

17. 膜的完整性与受精能力之间具有显著但可变的相关性膜的完整性与受精能力之间具有显著但可变的相关性 r = 0.05（Alm et al.,2001）；r = 0.39~0.57（Januskauskas , 2001） 膜 活力与受精能力之间具有可变的相关性。 r=0.15~0.83 （Kjaestad et al.,1993；Januskauskas et al.,2003） 顶体与受精能力之间具有显著的、可变的相关性 r = 0.60-0.84 （Withfield and Parkinson 1995；Januskauskas et al.,2000) 顶体 活力 受精能力 体外受精（IVF）与受精能力之间具有显著的相关性 r = 0.35-0.59 （Zhang et al., 1997；Schneider et al.,1999） 精子与透明带的结合能力与受精能力之间具有显著的相关性 r = 0.50 （Zhang et al.,1998） HZA IVF 实验室评估与精子质量、受精之间的关系

18. 实验室对精子分析评估时，在客观性、可重复性以及准确性上存在差异。实验室对精子分析评估时，在客观性、可重复性以及准确性上存在差异。 实验室 差异 精子只有在结构和功能上具备多方面的特性才具有受精能力。单一指标不能完全反映其受精能力，需多指标同时进行。 分析 差异 生产操作 差异 人工授精操作差异、不同的季节以及输精量等不同，都会造成受精结果的差异。 母畜方面，体质、年龄胎次的不同以及饲养管理的差异，均会影响到人工授精的效果。 精液品质分析及受精效果变化的原因 母畜差异

19. 精子检测的主要目的就是快速、准确地确定其受精能力，以满足科研及生产的需要。精子检测的主要目的就是快速、准确地确定其受精能力，以满足科研及生产的需要。 传统检测方法虽然比较简单，但存在主观性、可变性、检测指标与受精能力相关性差等缺点。因此应推广新技术用于精液检测。 精子需要同时具备多种特性和功能才能具有受精能力，因而单独的检测指标无法完全反映其受精能力。同时检测多个指标，才能更好地反映精子的受精能力。 精子质量评估未来的研究方向仍是继续寻找有效的预测精子受精能力的检测指标与方法。 展望

20. 谢 谢 ！