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第二十七章 立克次体及检验

第二十七章 立克次体及检验. 立克次体. 对人致病的立克次体有五个属立克次体属、 柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴 通体属。. 共同特点. ①大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病； ②以节肢动物为传播媒介或为储存宿主； ③大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性； ④除了少数外全是专性活细胞内寄生； ⑤菌体内同时含有 DNA 和 RNA 两类核酸； ⑥以二分裂方式进行繁殖； ⑦对抗生素敏感。. 一、斑疹伤寒立克次体. (一)临床意义 1．普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传

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第二十七章 立克次体及检验

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  1. 第二十七章立克次体及检验

  2. 立克次体 对人致病的立克次体有五个属立克次体属、 柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴 通体属。

  3. 共同特点 ①大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病； ②以节肢动物为传播媒介或为储存宿主； ③大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性； ④除了少数外全是专性活细胞内寄生； ⑤菌体内同时含有DNA和 RNA两类核酸； ⑥以二分裂方式进行繁殖； ⑦对抗生素敏感。

  4. 一、斑疹伤寒立克次体 (一)临床意义 1．普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传 斑疹伤寒)的病原体。 病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介， 而非储存宿主。 传播方式为虱-人-虱，体虱仅是传染媒介。

  5. 莫氏立克次体 • 地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒)的病原体。啮齿类动物是主§宿主，传播媒介是鼠蚤或鼠虱。 • 鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤寒立克次体从抓破的伤口进入人体。若有人虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地在人群中传播。

  6. 致病物质 • 有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖(LPS)；其二为磷脂酶A,能损伤宿主细胞膜及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿主细胞并在其中生长。 • 普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性器官损伤。

  7. (二)微生物特性 1. 比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚 集成团,分布在胞质内, Gimenez法染色后 呈红色，外表含有微荚膜结构。 2. 必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时 需要C02。通常采用5-9日龄鸡胚作卵黄囊接种，于32℃-35℃孵育4～13d内死亡，鸡胚死亡时间与接种剂量大小呈直接相关。普氏和莫氏立克次体能在多种单层细胞上生长繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分离。

  8. 3.有群特异性和种特异性两种抗原。大部分立克次体与普通变形杆菌X菌株的菌体耐热多糖抗原有共同的抗原性，故可用这些菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检测抗体，这种交叉凝集试验被称为外斐反应，可供辅助诊断。3.有群特异性和种特异性两种抗原。大部分立克次体与普通变形杆菌X菌株的菌体耐热多糖抗原有共同的抗原性，故可用这些菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检测抗体，这种交叉凝集试验被称为外斐反应，可供辅助诊断。

  9. 外斐反应

  10. (三)微生物检验 1.标本采集 (1)病人血液标本：发热期均有立克次体血症， 在急性期较易检出立克次体。争取在用抗生 素前采血，立即床侧接种。 (2)活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心 瓣膜等标本。

  11. 2.标本直接检查 (1)免疫荧光检测 用于脏器检查。制备标本片薄而均匀，组织结构清晰，固定后用荧光抗体染色, 常见脾、肺及心瓣膜中有立克次体，也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。 (2)核酸检测 PCR敏感性高，所需样品量只需ELISA实验的1／5。以编码17kD蛋白的基因和编码普氏和莫氏立克次体169kD蛋白的基因作为扩增靶区。

  12. 引物R17-1、-2在65℃条件下能扩增普氏和莫氏立克次体DNA。在琼脂凝胶上产生一条340bp的核酸带；引物R17-1、-2在65℃条件下能扩增普氏和莫氏立克次体DNA。在琼脂凝胶上产生一条340bp的核酸带； • 引物R169-1、-2仅能扩增普氏立克次体DNA，产生一条432bp的核酸带。两种引物同时使用，扩增后普氏可产生340bp和432bp两条带，而莫氏只产生340bp一条带。 • 该法敏感性可达0．05ngDNA水平，重复性好，操作方便，对两型立克次体早期、鉴别诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价值。

  13. 3．分离培养 (1)动物接种 选用健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现象。每日测体温，至40℃发热时采血或脏器悬液、接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以分离立克次体； 感染莫氏立克次体豚鼠在发热1—2日内出现阴囊红肿，解剖可见腹股沟淋巴结肿大、充血、脾大2-3倍，有腹水；有阴囊反应者，睾丸有小出血点，鞘膜充血并有浆液性渗出物等。鞘膜涂片可查到立克次体。

  14. (2)鉴定 • 用免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵黄囊、细胞培养物中的特异性抗原以已知抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体。必要时用补体结合试验、微量凝集试验等，作群和种的鉴定。

  15. (3)分离株繁殖及保存 ①鸡胚卵黄囊培养 收获卵黄囊，经涂片染色镜检, 含立克次体较多而又未发现细菌的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬液置-70℃冰箱保存，或冰冻干燥保藏； ②细胞培养：选鸡胚、成纤维、人羊膜、HeLa等细胞，接种培养、鉴定后将立克次体大量繁殖的感染细胞置-70℃储存。

  16. 4．抗体检测 立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐 反应、间接免疫荧光(IFA )试验、酶联免 疫吸附试验(ELISA)外，还有补体结合(CF) 试验、微量凝集(MA)试验、间接血凝(IHA) 试验、胶乳凝集(LA)试验等 。

  17. (1)外斐反应 除Q热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性 外，其他为阳性。 患者OX凝集素上升较晚，在病程2周左右方出 现阳性，病程中双份血清试验，若效价有4倍 增长，方有诊断意义。

  18. 有些病例在病程中效价不见上升，约15％的经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血清学试验阳性，但外斐反应可为阴性。有些病例在病程中效价不见上升，约15％的经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血清学试验阳性，但外斐反应可为阴性。 斑点热病人外斐反应效价通常为OX19高于OX2，但也有OX2较高者。若仅出现OX2阳性，则对诊断斑点热有特殊意义。

  19. (2)IFA试验 为现在诊断立克次体病常用的方法。用已知 立克次体抗原(感染鸡胚卵黄囊或细胞培养 悬液)制片，以低稀释度的病人血清初筛， 有呈典型立克次体形态的明亮荧光颗粒者， 判为阳性。再将病程早期及晚期血清分别作 双倍或4倍稀释以测效价，如呈4—8倍增长 者可明确诊断。

  20. (3)ELISA • 检测IgM抗体对早期诊断有价值。 • 立克次体抗原吸附于载体。泛影葡胺梯度离心纯化抗原为优，检出血清的抗体效价高，纸上ELISA测定抗体，方法简便。将感染卵黄囊悬液加于玻片(经氯仿·甲醇洗净)上，凉干、固定，加稀释血清于抗原点上，每张玻片上包括阳性和阴性对照，加酶标兔抗人IgM/G于抗原·血清点作用后，将浸透新鲜配制的底物无灰滤纸覆盖在玻片上约4-6min，可见滤纸条上阳性对照点位置显紫棕色，取下滤纸条(即终止反应)，观察是否显色，与对照比较判定结果。此法简便，并可保存实验记录。

  21. (4)CF试验 CF试验原来是立克次体病血清学诊断的经典试验，虽然敏感性不如IFA和 ELISA，但非常特异。一般在立克次体病发病一周内，血清中即有CF抗体出现，以后逐渐上升，至第3周达最高峰，然后逐渐降至较低的效价，并可保持几年不消失，但也有在病后几周即转阴性者。病人恢复期血清与斑疹伤寒群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳性结果，只能说明该群立克次体的感染 。

  22. 三、恙虫病立克次体 又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙 螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放 的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮 疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各 组织器官的血管炎病变。虫咬处溃疡形成黑 色焦痂，周围有红晕等为其特征。为自然疫 源性疾病。

  23. (一)微生物特性 1．具有多形性，但以短杆状为常见。G-,姬姆 萨染色呈紫红色, Gimenez染色呈暗红色， 背景为绿色。可以鉴别恙虫病立克次体和 其他立克次体。分布在细胞质内，密集于 细胞核旁。细胞内寄生。

  24. 2．培养特性 (1)动物接种：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘液涂片检查，可见细胞质内有大量立克次体，尤以腹膜上皮细胞内多见，常密集于细胞核旁。

  25. (2)细胞培养：恙虫病立克次体可以在多种细胞内生长、繁殖，多采用Vero、L929细胞进行培养。细胞感染需要适宜的温度和吸附时间，通常以37℃吸附1h，培养32℃为宜，繁殖缓慢，用Vero细胞培养8—9d，在细胞质内生长繁殖，在细胞核旁高度密集，但不侵入细胞核。(2)细胞培养：恙虫病立克次体可以在多种细胞内生长、繁殖，多采用Vero、L929细胞进行培养。细胞感染需要适宜的温度和吸附时间，通常以37℃吸附1h，培养32℃为宜，繁殖缓慢，用Vero细胞培养8—9d，在细胞质内生长繁殖，在细胞核旁高度密集，但不侵入细胞核。

  26. 3．抗原成分 • 恙虫病立克次体具有耐热性多糖抗原和特异性抗原。 • 恙虫病立克次体和变形杆菌OXk株有共同的抗原成分，在Weil-Felex反应中，血清与OX，抗原发生凝集而不与OX19、OX2发生凝集。

  27. (二)微生物检验 (1)抗原检测：ELISA间接法是检测标本的特异性抗原或抗体的最常用方法。 (2)PCR：可检出20ng恙虫病立克次体DNA；套式PCR法可检出200pg，是目前最为快速、特异、敏感的实验室诊断方法，可用于急性期患者的早期诊断。 依据56KD蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因 序列选择引物，进行目的 DNA 扩增，然后用 1．5％琼脂糖电泳法检出特异性DNA带。

  28. (3)分离培养 接种小鼠分离病原。将标本接种腹腔O．5ml，一般多在7～18天死亡，感染小鼠有明显症状，濒死前解剖，可见皮下淋巴结肿大充血，脾肿大，有粘稠的腹腔渗出液，以Giemsa染色镜检，在靠近细胞核旁边可见成堆排列的立克次体。也可接种Vero细胞、L929细胞进行立克次体分离培养。细胞培养10—15天，取细胞涂片，Giemsa染色镜检。

  29. (4)抗体检测 • 外斐试验：临床血清学诊断方法，血清抗体OXk效价达l：160以上有意义，病程中双份或多份血清试验，若效价有4倍增高，有诊断意义。由于外斐试验特异性、敏感性低，容易造成误诊或漏诊，不应作为恙虫病的诊断方法。

  30. 免疫荧光试验：快速敏感特异，可分别检测患者血清中的抗恙虫病立克次体lgG、IgM抗体，效价在1：80以上有诊断意义。双份血清有4倍或以上增长可以确诊。免疫荧光试验：快速敏感特异，可分别检测患者血清中的抗恙虫病立克次体lgG、IgM抗体，效价在1：80以上有诊断意义。双份血清有4倍或以上增长可以确诊。

  31. 四、贝纳柯克斯体 • 又称Q热立克次体，是引起Q热(疑问热，指最初不明病因的发热)的病原体。 • 传染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱为传播媒介，对人感染力特别强，通过接触、呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染。 • Q热除有发热、头痛及肌肉痛外，以出现肺炎和肝炎为其临床特征。 • 慢性Q热主要表现为心内膜炎。

  32. （一）微生物特性 1.形态与结构 个体较小，多为短杆状，常排列成对，Gimenez法染色呈红色，背景呈绿色，用Giemsa法染色呈紫红色。有荚膜，在鸡胚卵黄囊或细胞培养内均可有芽胞形成。 2.基因组与抗原成分 基因组分子量为大肠杆菌的1／3；编码代谢酶、表面抗原与毒力因子有关基因。有两相抗原，Ⅰ相为光滑型LPS，Ⅱ相为粗糙型短链LPS。

  33. 3．培养特点 鸡胚是培养的极好宿主。一般经培养10— 12d，1g卵黄囊膜常可获得约1000μg纯净 的立克次体能在多种人和动物的原代或传 代细胞内繁殖。一般不引起明显的细胞病 变。

  34. 4．抵抗力 • 贝纳柯克斯体抵抗力强，70℃ -90℃加热30—60min尚难杀死。 • 1%福尔马林作用24小时也不能完全灭活。对氯霉素和四环素类抗生素敏感。

  35. (二)微生物检验 (1)标本直接抗原检测：免疫荧光法进行检测。 (2)标本直接核酸检查：按16SrRNA非保守区序列合成寡核苷酸探针，能检出5pgrRNA，如将非保守区特异性扩增，其敏感性可达检出1—10个贝纳柯克斯体的水平。 用贝纳柯克斯休质粒DNA片段制备的探针，不仅能快速检出病原体，且能鉴别含QpHI或QpRS质粒分离株，与呼吸道感染病原体DNA无交叉反应。试验仅需8—12h即可得到结果。

  36. 3．分离培养 • 病原体分离只是在该地区尚未证明有Q热存在，病情特别严重有必要。将标本接种于豚鼠或培养细胞，观察其发病与否或生长情况，经形态学、血清免疫学等鉴定后作出结论 。

  37. 4．抗体检测 用间接免疫荧光试验、ELISA和CF试验。 CF试验中抗原相的选择对结果影响极大，对现症诊断主要看Ⅱ相抗体逐渐上升，若Ⅰ相抗体保持较高水平，则往往说明慢性感染或隐性感染。

  38. 五、埃立克体 (一)临床意义为埃立克体病病原体。 1.人腺热埃立克体病 可能由蜱传播，也 可能由于摄食生鱼引起。临床表现为发 热头痛、淋巴细胞数增加，并出现非典 型淋巴细胞。。 2.人单核细胞埃立克体(HME)病，主要侵 染人的单核细胞和巨噬细胞。传播媒介 为蜱。

  39. 3．人粒细胞埃立克体(HGE)病 主要侵犯人 粒细胞。硬蜱是传播媒介。也是莱姆病 病原体的携带和传播者，故与莱姆病的 相重叠。

  40. （二）微生物特性 1．为G-小球菌，呈多形性，Romanows染 色呈兰色和紫色。吞噬细胞以内吞的方 式将埃立克体摄入胞内，在胞质内以二 分裂的方式繁殖，形成包涵体。称为桑 椹体。

  41. 2．基因组 埃立克体的16SrRNA基因极保守， 但5’端的50—100碱基为高变区，适合设计 PCR引物或核酸杂交探针。人粒细胞埃立 克体的外膜蛋白44kDa蛋白被克隆，可用 作探针。 3．抗原成分 在埃立克体属内的各种埃立克 体均可有血清学交叉反应。

  42. (三)微生物检验 1.标本直接显微镜检查 采集病人的外周血制备血片，经Giemsa或Wright染色，在光镜下发现粒细胞及单核细胞质或血小板内有圆形、深紫色的桑椹体，可作为急性期埃立克体病的一种简便和有效的辅助诊断方法。

  43. 2.核酸检测 PCR是最有效的埃立克体病的病原学诊断方法，可用于埃立克体病的早期诊断。大约80％-87％HME和43％-75％的HGE患者的血标本被PCR检测为阳性。 特异性几乎为100％，主要依赖引物的特异性。可用16SrRNA基因设计引物或做基因探针。有极高的敏感性，感染后数天就可检出阳性结果。

  44. 3.细胞培养 • 查菲埃立克体可用犬巨噬细胞系(DH82)，腺热埃立克体用小鼠的巨噬细胞系(P388D1)，人粒细胞埃立克体则用人的粒细胞白血病细胞系(HL-60)作它们的体外培养的宿主细胞。 • 将3ml抗凝血的白细胞层，接种细胞单层，置 37℃的5％C02孵育箱中培养，每隔3-4天换一次细胞维持液，并刮少许细胞涂片，用Giemsa染色，在光镜下检查埃立克体包涵体。

  45. 4.小鼠接种 从蜱体内分离埃立克体让蜱叮咬小鼠和吸血。或将病人或动物的抗凝血的白细胞注入小鼠腹腔。观察小鼠发病。 定时采小鼠血作涂片染色、IFA、PCR等证明小鼠被埃立克体感染，用腹腔液涂片染色镜检包涵体。

  46. 5.抗体检测 (1)间接免疫荧光(1FA)： 将感染血清作倍比稀释，加入抗原孔内， 置湿盒37℃孵育lh；玻片冲洗后，用 Evans蓝作背景染色，然后每孔加一滴固 定液，加盖玻片，在荧光显微镜下检查感 染细胞内的带荧光的包涵体，通常血清中 抗体滴度 1：20为阳性。若获双份血清效 价增高4倍以上即可明确诊断。

  47. (2)免疫印迹 采用免疫印迹检测埃立克体病患者血清 中抗埃立克体主要抗原组分的抗体，可 以改善血清学检测的特异性。经免疫印 迹分析发现HME患者血清中含有抗查菲 埃立克体的44kDa抗原组分的IgG抗体。 但不能用于埃立克体病的早期诊断。

  48. 六、汉赛巴通体 • 引起杆菌性血管瘤—杆菌性紫癜(BAP)和猫抓病(CSD)的病原体。常在免疫缺陷病毒(HIV)感染者发生，也感染有免疫潜能的人群，与接触猫有关。为G-营养要求苛刻的需氧杆菌，为兼性胞内寄生菌。

  49. 猫抓病有与猫接触史，抓咬部位形成丘疹脓疱，继而出现淋巴结肿大，约10％病例有肉芽肿性结膜炎、骨质溶解、肺炎及中枢神经系统损害等。猫抓病有与猫接触史，抓咬部位形成丘疹脓疱，继而出现淋巴结肿大，约10％病例有肉芽肿性结膜炎、骨质溶解、肺炎及中枢神经系统损害等。

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