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  1. Microarray Identification de FMRP- Associated Bian mRNAs and Altered mRNA Traslational Profiles in Fraglie X Sindrome.

  2. Introducción. El sindrome de Fragil X es una causa comun del retraso mental, el cual se debe a una deficiencia en l proteina FMRP. -Fragile X Mental Retardation Protein-. FMR1 FMRP Gen ligado al Cromosoma X. (CGG)n lidera el silenciamiento transcripcional del gen FMR1

  3. FMR1 y sus paralogos autosomicos FXR! Y FXR2 codifican proteinas de union al ADN. Comparten 60% de su identidad de aa. FMRP Se une a RNA homopolimerico (poly A). Se une a un subset de ARN proveniente del cerebro. Citoplasmatica: incrporada dentro de un complejo ribonucleoproteico unido a un mensajero – FMRP- mRNP Purificada posee capacidad intrinseca de union al RNA. El complejo FMRP-mRNP esta asociado con poliribosomas traduccionales.

  4. FMRP

  5. Una MUTACIÓN sin sentido en el segundo dominio KH de FMRP (1304N) que tiene como resultado un fenotipo grave de sindrome genera la incapacidad para la asociación con lo polirribosomas. Hipótesis: Cuando FMRP está ausente los mRNA normalmente asociados con el complejo FMRP-mRNP podrían verse desregulados traduccionalmente; lo cual llevaría a deficiencias cognitivas en el cerebro.

  6. Objetivos: Microarrays Identificación de mRNA asociados al complejo FMRP-mRNP en cerebro de ratón. Identificación de mRNA de cel humanas con el síndrome, que polirribosomas anormales por la ausencia de FMRP Se obtendrá un subset de ARNm que se asocian a FMRP- mRNP in vivo que poseen pefil polirribosómico anormal.

  7. Inmunoprecipitación

  8. Resultados: Aislamiento e identificación de mRNAs asociados con FMRP conteniendo partículas de mRNP. Estrategia: inmunoprecipitar especificamente FMRP conteniendo partículas de mRNP e identificar los mRN coinmunoprecipitados usando microarrays.

  9. Inmunoprecipitación del complejo FMRP-mRNP. A- Analisis de Western blot competitivo. Testear el anticuerpo

  10. Para FMRP de ratón, se utilizan anticuerpos monoclonales (mAb 7G1.1) por inmunización de ratones knockout Fmr1 con FMRP. El epítope reconocido fue mapeado en una región de no homología con las proteínas Fxr1 y Fxr2.

  11. Inmunoprecipitación del complejo FMRP-mRNP. A- Anlisis de Western blot competitivo. Testear el anticuerpo

  12. Western blot obtenido de SDS PAGE 7.5% IP de FMRP con mAb7G1-1: Ig: Ac, none: nada, M2: proteína inerte, 7G1-1#1: péptido específico. Revelado con Ac 1C3

  13. Inmunopresipitación de complejos FMRP-mRNP B- Inmunoprecipitacion con mAb 7G1-1 y probadoo con anti- anticuerpo C13. Este Ac inmunopresipita al menos tres isoformas de FMRP. KO: no presenta FMRP a: isoformas d: Ac lysate: lisado total flow thru: lo que queda luego de IP.

  14. Western blot para Parálogos FXR2P y FXR1P revelados con: a: antiFMRP (1C3), b: antiFXR2P (A42), c: antiFxr1, d: Ig. Extracción de RNA, obtención de cDNA y visualizado por autorradiografía.Observación de ARN poly A.

  15. excitation scanning cDNA clones (probes) laser 2 laser 1 PCR product amplification purification emission printing mRNAtarget) overlay images and normalise 0.1nl/spot Hybridise target to microarray microarray analysis Microarreglos • Permiten analizar simultáneamente la expresión de genes. • La técnica consiste en fijar miles de fragmentos de DNA ordenados, a una superficie sólida, generalmente de cristal. • Cada secuencia corresponde a un gen diferente. • El mARN es tomado de una célula o tejido particular, se realiza RT-PCR y se marca para generar una muestra etiquetada. Esta muestra es “hibridizada” sobre los “probes” del microarreglo. • La muestra marcada se encontrará con su secuencia complementaria. • La cuantificación de la expresión génica se da por el procesamiento de las imágenes obtenidas de los microarreglos. • Se puede utilizar mas de un fluorocromo para distintas muestras

  16. Análisis de los ARNm residentes en el complejo FMRP-RNPm por microarreglos • Se utilizaron matrices de oligonucleótidos, Affimetrix Murine Genome (MG-U74) y Murine 19K (MU19k). • Se prepararon lisados de wt y KO. Del 20% se aisló el ARN total (imput-RNA) y al resto se le resalizó una imnunoprecipitación con 7G1-1mAb,y se aisló el ARN del precipitado (ARN-IP) • Se generaron ARNc de las muestras de wt-ARN-IP, KO-ARN-IP y ARN-imput, y fueron hibridadas en paralelo con MG-U74.

  17. Análisis de los ARNm residentes en el complejo FMRP-RNPm por microarreglos La identificación de los ARNm coinmunopresipitados con el complejo FMRP-ARNm se realizó mediante microarreglos de oligonucleótidos de “Affymetrix Murine Genome U74” (MG-U74) y “Murine 19K” (Mu19K). Se analizaron 25181 ARNs del la base de datos UniGene y 19021 mensajes de la base de datos TIGR. Input: chip MG-U74 hibridizado con ARNc generado del ARN total de lisado wt WT-IP: wt ARN coIP con FMRP KO-IP: ARN IP de Fmr-1 KO.

  18. ARN-imput muestra fluorescencia intensa • Menos del 0.05% del ARN total cambió al comparar wt vs KO (no mostrado) • En wt-IP se vé pérdida sustancial de intensidad • En KO-IP hay mayor pérdida. Las señales probablemente se debieron a interacciones de fondo con la matriz de anticuerpos independientes de FMRP

  19. De 25181 genes de la matriz, 11064 (44%) estaba presente en wt-imput • Se comparó el perfil de ARN-wt-IP con el perfil del ARN-KO-IP, y luego el perfil de ARN-wt-IP con el perfil del ARN-imput. • Primero se identifica los ARN independientes de FMRP, asociados con la matriz de anticuerpos y luego se identifica los ARNm presentes en el wt-IP relativos al wt-imput, descartando los que tengan alta abundancia en el wt-imput, ya que podría ser responsable de su presencia en el wt-IP.

  20. Análisis de los ARNs coinmunopresipitados con FMRP-mRNP La intersección de 432 (3.9%) sugiere que casi el 4% de los mensajeros se encuentran asociados a FMRP. Diagrama de Venn de los ARNs asociados con el complejo FMRP-ARNm Cuadro: genes disponibles en el MG-U74 Blanco: genes detectados en el lisado total wt. Rojo: genes enriquecidos (4 veces o más) en el wt-IP comparado con el KO-IP. Verde: genes enriquecidos en el wt-IP versus el lisado total. Amarillo: genes enriquecidos en el wt-IP en ambos casos.

  21. RNAs mensajeros asociados con Fmrp-mRNP en cerebro de ratón. En la tabla 1 se muestran los 80 ARNm mas enriquecidos. El orden se estableció se por la suma: (wt-IP versus KO-IP) + (KO-IP versus input). El mayor enriquecimiento fue para el ARNm KIAA0763 relacionado con Sec7, identificado por homología como el factor intercambiador del nucleótido de guanina.

  22. Se realizó otro experimento independiente de IP que se analizó en la matriz MU19K • Usando los mismos criterios de comparación: • 36 de 80 genes no estaban en la matriz • Se confirmó el enriquecimiento para 28 de los 44 que sí lo estaban.

  23. Confirmación de la asociación entre FMRP-mRNP y los ARNm identificados por microarreglos • Con el fin de demostrar independientemente que los ARNm en la Tabla 1 están asociados a FMRP-RNPm. • Se realizaron IP en presencia de competidores: ARNt de levadura y Heparina No alteraron la asociación especifica

  24. Se IP del lisado wt y KO, con una RNP nuclear pequeña (snRNP), U1-70K con AC anti U1-70K mAb, simultáneamente con FMRP-RNPm. El Ac anti U1-70K precipitó eficientemente a este RNP del lisado wt y KO, mientras que el AC anti FMRP el mAb 7G1-1 solo lo precipita a este del wt como era esperado.

  25. Western blot Izq: IP con Ac anti U1-70K y revelado con AC anti proteína U1-70K. Der: IP con AC anti FMRP 7G1 y revelado con AC anti 1C3 de FMRP Lysate : lisado total Paréntesis : Ac

  26. El ARN recuperado de cada precipitación fue purificado y analizado por RT-PCR. • Se realiza este ensayo con 8 ARNm previamente identificados, como enriquecidos en las IP de MicroArrays del wild type. • También para un set de ARNm no enriquecidos por la IP del wild type en los ensayos de MicroArrays.

  27. RNP: ARNm: ENRIQUECIDOS en MicroArrays Electroforesis en PAGE de los productos de RT-PCR. Tot. ARN: ARN total de cerebro de ratón (0.1µg). U1: IP anti U1-70K F: IP anti FMRP Izq: marcador de peso molecular NO ENRIQUECIDO

  28. Para confirmar los datos del microarreglo, se realizó LightCycler RT-PCR cuantitativo (PCR en tiempo real) del IP-wt y el lisado total wt. El LightCycler permite la automatización de la PCR, cuantificando en tiempo real la amplificación de una secuencia blanco, mediante el uso de curvas estándar. El fundamento de esta tecnología es la utilización de aire para el ciclo de calentamiento-enfriamiento al que se someten las muestras durante la corrida. La cuantificación de los productos amplificados se realiza utilizando un micro-fluorímetro acoplado al aparato. En una corrida normal, 20 milisegundos son suficientes para medir una muestra.

  29. Se realiza un análisis de LightCycler RT-PCR cuantitativo a 3 ARNm que no se encontraban enriquecidos en el wt-IP en relación con el input-IP. • Simultáneamente se realiza este ensayo a 3 ARNm enriquecidos en el wt-IP en relación con el input-IP.

  30. Verificación de los datos de microarreglos usando LightCycler Real-Time PCR NO enriquecido Enriquecido En la tabla 2 se ve que de 3 ARNm testados que no se encontraron enriquecidos en los microarreglos de wt-IP, todos presentaron un pequeño incremento luego la RT-PCR. Por otro lado, tres genes que si estaban enriquecidos en los microarreglos de wt-IP relativo al lisado total, se vieron altamente enriquecidos en el IP luego de la RT-PCR. Estos resultados confirman los resultados de los microarreglos.

  31. Perfiles polirribosomales alterados de ARNm en ausencia de FMRP • Se quiere definir algún atributo funcional de esta asociación. • Se realiza centrifugación en gradiente de sacarosa, que separa los ARNm según su asociación relativa a los ribosomas. • Se busca observar cambios en los perfiles de la fracción de polirribosomas para un sub-set de ARNm.

  32. Espectro de Absorción Fracción Polirribosomas .

  33. Con las fracciones 9 a 11, se preparo ARNc para hibridar en Microarreglos. • Se comparo perfiles de ARNm de fracciones polirribosomales de cepa normal y con Fragile-X.

  34. Dendrograma de genes con cambios significativos en los perfiles de la fracción polirribosomal de las células Genes que están presentes en mayor nivel están representados con color rojo aquellos que presentan menor presencia frente al paciente se ven en verde aquellos con igual representación se ven en. FMR1 gen, se ve en menor intensidad tanto en la fracción total como en las fracciones poli ribosómicas

  35. Para confirmar mas los datos, se examinó las distribuciones de NAP- 22 y MKPX en fracciones frescas de gradiente de sacarosa por Northern blot

  36. Ambos disminuyeron en las fracciones polirribosomales de las células de Fragil X, aunque no hubo diferencia en el Arn citoplasmático total. • Se revela un cambio más notable en el perfil traduccional de las células Fragil X • GADPH fue el control, no mostrando diferencias a lo largo del graciente. • Se confirma el cambio selectivo en el perfil traduccional de un subgrupo de ARNm en ausencia de FMRP

  37. DISCUSIÓN • Diversos estudios han caracterizado el comportamiento de unión al ARN de FMRP . • Aquí se identifica el repertorio de ARNs asociados in vivo con el complejo endógeno FMRP. • Se muestran los cambios del perfil traduccional en ausencia de FMRP

  38. Identificaión a gran escala de ARNm asociados a FMRP-mRNP • Se encontró que el complejo FMRP-mRNP se relaciona con el 4% de los genes expresados en el cerebro de ratón. • Mensaje de Fmr1:no está entre estos mensajes a pesar que estudios in vitro muestran la asociación de FMRP con su propio ARNm. • Se detectó a nivel moderado en el lisado cerebral del wt (diferencia de 144 con imput) y no se detectó (como se esperaba) en el lisado imput-KO.

  39. En comparación, 32% de los genes expresados tienen intensidades de señal mayor que la de FMr1 en el lisado imput. • Incremento moderado de 4,2 veces en el transcripto FMR1 al comparar el ARN-wt-IP con el ARN-KO-IP, pero no se encontró enriquecimiento al compara el ARN-wt-IP con el ARN-wt-input

  40. Aunque el transcripto Fmr1 podría ser un ligando de FMRP, según los datos presentados, es probable que hayan otros mensajeros con mayor avidez para el complejo mRNP. • En contraste con Fmr1, otros ARNm fueron detectados a nivele muy bajos en el lisado de cerebro wt input, mientras que estaban enriquecidos en el complejo FMRP-mRNP. KIAA0561-like protein Prot. De intercambio GDP/GTP Rab 3 Celera ARNm hCT25324

  41. RT-PCR cuantitativo LightCycler confirmó que el grupo de transcriptos que se enriquecieron en los datos de microarreglos también estaban de 30 a 60 veces enriquecidos en el wt-IP en comparación con el lisado input (incluye transcriptos de tabla 1) • Presencia de falsos negativos Ejemplo: caso del transcripto NAP-22

  42. Transcripto NAP-22 • Microarreglo Mu 19K: Enriquecido en wt IP • Microarreglo MG-U74: No se detectó • Muestra un cambio en su perfil traduccional en ausencia de FMRP • El RT-PCR cuantitativo mostró que se enriquecía 63 veces en el wt-IP en relación con el lisado de cerebro total.

  43. El microarreglo MG-U74 presenta distintos oligonucleotidos que los de Mu 19K, es probable que los dos estén evaluando distintas isoformas o distintos miembros de la familia de algunos genes. • Esta discrepancia, junto con el alto nivel de rigurosidad utilizado en el análisis, sugiere que podrían haber subestimado el número de transcriptos asociados con FMRP-mRNP

  44. Asociación polorribosómica alterada de ARNm`s en ausencia de FMRP • H. FMRP es incorporada al complejo mRNP con sus ARNm`s ligados asociándose con polirribosomas traductores modulando la traducción de los ARNm ligados. • Microarreglo: Identificaron un grupo de ARNm alterados en la fracción polirribosomal de alto PM en células X-fragil

  45. Esto podría implicar una alteración en la regulación de la traducción en ausencia de FMRP

  46. ARNm´s especificos de FMRP y estructura de cuarteto de G´s • Encontraron que sólo el 2% de los genes expresados testeados mostraron un cambio en el perfil traduccional en ausencia de FMRP. Problemas. • IP a partir de lisado de cerebro de ratón (Ac 7G1-1) • Estudios en células humanas no cerebrales.

  47. Existen limitaciones al comparar los sets de datos debido a expresión tejido-especifico y a microarreglos especie-específicos. • Sin embargo, los datos respaldan la idea de que los complejos FMRP-mmRNP reconocen ARNm específicos y regulan su traducción.