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实验九 PCR 扩增检测转基因大豆、玉米

实验九 PCR 扩增检测转基因大豆、玉米. 【 实验目的 】 通过 PCR 扩增方法检测市场常见大豆、玉米产品是否含有转基因成分 培养学生的实验设计能力和创新能力. 【 实验原理 】. 以大豆特异性内源基因大豆凝集素 (Lectin) 基因或者玉米特异性内源基因 IVR 为内参， 花椰菜花叶病毒 35S 启动子 (CaMV35S 启动子 ) 、农杆菌胭脂碱合成酶终止子 (NOS 终止子 ) 及外源基因 5- 烯醇丙酮 - 莽草酸 -3- 磷酸合酶 (CP4-EPSPS) 基因为靶基因检测大豆和玉米中的转基因成分。.

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实验九 PCR 扩增检测转基因大豆、玉米

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Presentation Transcript

  1. 实验九 PCR扩增检测转基因大豆、玉米 【实验目的】 • 通过PCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米产品是否含有转基因成分 • 培养学生的实验设计能力和创新能力

  2. 【实验原理】 以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin)基因或者玉米特异性内源基因IVR为内参， 花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动子)、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)及外源基因5-烯醇丙酮-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4-EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中的转基因成分。

  3. 【实验步骤】大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法 • 称取0.1g样品，在研钵中充分研磨。加入1000μL CTAB提取液，继续研磨充分后加入到1.5mL Ep管中；向EP管加入4μL RNaseA，至于65℃水浴，过程中混匀3~5次，30min，12000r/min室温离心10min；取上清于新的Ep管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24: 1)，轻缓颠倒数次(或至于漩涡震荡器上混匀)，室温静置5min，室温12000r/min离心10min；重复加入氯仿异戊醇一到两次 (过程中如上清液量太少，可适量加入三重蒸馏水)；取上清于新的Ep管(千万不要吸入下层液体)，再加入等体积的CTAB沉淀液，轻缓颠倒混匀后室温静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上清液，加入400μL 1.2mol/L氯化钠溶解沉淀，56℃温浴15min，期间轻摇EP管数次助溶；加入800μL -20℃无水乙醇，-20℃静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两三次后，在室温下自然风干用三重蒸馏水溶解储存于4℃。

  4. 【实验步骤】基因组DNA浓度和纯度的鉴定 • 取5μL样品溶于95μL三重蒸馏水中，用 Biophotometer分析DNA的浓度，通过它对提取大豆DNA测OD值。并记录数据。由OD260nm/OD280nm判定基因组DNA的浓度，其比值在1.7~2.0之间较好，符合PCR检测要求。

  5. 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 它包括: 变性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

  6. 主要试剂 Taq DNA polymerase 底物：10mMdNTP 引物对：1μmol/L PCR缓冲液 ddH2O

  7. 主要实验器材

  8. PCR主要操作步骤 标记试管 加入各种试剂、混匀、离心（最后加酶） 设立PCR循环程序，进行扩增

  9. 标记PCR反应管

  10. 加入试剂

  11. 【实验步骤】 • 1. 在0.2 mL Eppendorff管内调制50 μL反应体系：

  12. 反应管放入PCR仪

  13. 编辑程序进行扩增

  14. PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸。

  15. 2. 按下述程序进行PCR扩增: • 1） 94℃ 预变性 3 min； • 2） 94℃ 变性 1 min； • 3） 54℃ ( 或者56℃ )退火 45 sec； • 4） 72℃ 延伸 1 min； • 5） 重复步骤2~4, 29次； • 6） 72℃ 延伸 10 min； • 7） End.

  16. 3. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果 • 配制0.8％琼脂糖凝胶，取PCR产物5μL加1μL点样液混合后点入上样孔，于120V电压电泳20~30min。电泳结束后，用自动凝胶成像分析系统检测

  17. M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7 外源基因( EPSPS)特异性扩增 内源基因(Lectin)特异性扩增 1 2 3 4 5 6 7 M M 1 2 3 4 5 6 7 1 2 外源启动子(CaMV35S)特异性扩增 外源终止子(NOS) 特异性扩增 1 未加模板对照 2 转基因大豆、玉米 3~7 非转基因大豆、玉米

  18. PCR假阳性结果 1． 引物设计不当，应调换引物 2． 循环参数不合适，导致非特异性扩增 3． 靶序列的交叉污染 PCR假阴性结果 1． 模板问题 2． 试剂浓度不够 3． 标本中有Taq酶的抑制剂 4． PCR产物检测系统灵敏度不够

  19. 【注意事项】 1 提取高质量的模板DNA是PCR成功的决定因素之一 2 注意防止试剂的交叉污染

  20. 五 结果处理 分析PCR产物电泳结果，判断所测样品是否含转基因成分。

  21. 【思考题】 • 1、影响PCR反应效率的因素有哪些？ • 2、为什么检测转基因大豆或者玉米时，以大豆凝集素(Lectin)基因、玉米特异性内源基因IVR为内参 ？

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