LIPIDPEROXIDÁCIÓ ÉS A BIOLÓGIAI ANTIOXIDÁNS VÉDELEM

1. LIPIDPEROXIDÁCIÓ ÉS A BIOLÓGIAI ANTIOXIDÁNS VÉDELEM Life is a constant battle against becoming rancid... (P. Cloud, 1979)

2. Szabad gyökök: azok a kémiai gyökök, amelyek külsőelektronhéjukon egy vagy több párnélkülielektront vagy antiparalell spinekkel rendelkező elektronokat tartalmazó atomot tartalmaznak. Oxigén szabad gyökök: azok a szabad gyökök, amelyekben a párnélküli elektron vagy elektronok egy oxigén atom külső orbitálján helyez- kedik el.

3. Szabadgyökök Szuperoxid (O2-):enzimatikus, auto-oxidációs, nem-enzi- matikus elektron transzfer reakciók során keletkezik. Vizes oldata oxidálja az aszkorbinsavat, redukálja a cito- krom c és más kelát vas atomját. Hidroxil (OH) : rendkivül reaktiv gyök, amely minden bio- lógiai molekulát oxidál Peroxil, alkoxil (RO2, RO) : tipikus szerves oxigén sza- bad gyök,amely a lipid peroxidáció során (is) keletkezik, amikor a hidroperoxidokat az átmeneti fémek redukálják. A szén-tetrakloridból képzõdõ gyökis ebbe a csoportba tartozik (CCl3O2)

4. Alkil-peroxil (ROO): az alkoxil gyök által indukáltlánc- reakció soránkeletkezik a lipid peroxidáció folyamata során. Nitrogén-oxidok (NO, NO2): a nitrogén-oxid in vivo az L-argininbõlkeletkezik. A nitrogén-dioxid akkor keletkezik, amikor a NO oxigénnel reagál (pl. szmog, dohányfüst)

5. Nem szabadgyökök Hidrogén-peroxid (H2O2): in vivo a dizmutázok és számos oxidáz hatására, valamint a hidroxil gyök és átmeneti fém jelenlétében islétrejöhet. Kis koncentrációban kevéssé reaktiv, de nagyobbmennyiségben károsítja a sejtek energia-felszabaditó rendszerét. Hipoklór-sav (HOCl): a mieloperoxidáz hatására a neutro- filsejtek termelik gyulladásos folyamatok során.Szuper- oxidanionnal reagálvahidroxil gyök is létrejöhet a neutrofil aktiváció során. Ózon(O3): a légkörben keletkezik. Rendkivül reaktiv gáz. A vérplazmaantioxidánsok közül oxidálja (bontja) a D- és E- vitamint és a húgysavat.

6. Szinglet oxigén (1O2): az oxigén külsõ két orbitálján lévõ egyik elektron inverz spinnel rendelkezik, emiattmegválto- zik a molekuláris oxigén kvantum-mechanikai stabilitása. Afotoszintézis során a membránokhoz kötött oxigén szállí- tássorán keletkezik növényekben. Szerves peroxid (ROOH): a lipidek oxidációs terméke a lipidperoxidáció során, amely főképp szinglet oxigén hatására keletkezik

7. AZ OXIGÉN SZABADGYÖKÖK FORRÁSAI • Mitokondriális és mikroszomális (kloroplasztisz) elektron transzport - oxigén tetravalens redukciója 1O2O2H+ h  e- e-, H+ e-, H+ e-,H+ 3O2O2-H2O2OHH2O 2. Fagocitózis során a PMN leukocitákban H2O  H2O2 H2O + Cl-  HOCl + H+

8. 3. Enzimrendszerek működése során: - NADP oxidáz - Xantin – oxidáz - Monoamin - oxidáz - Citokrom P450 – oxidáz 4. Hidroxil gyök (OH) keletkezésének egyéb útja: Fenton és Haber-Weiss reakciók révén (Fenton, 1894, Haber és Weiss, 1934): O2 + e- (O2)- (O2)- + H2O2+ Mn HO- + (OH) + O2+ Mn+1

9. 4. Szuperoxid anion (O2- ) keletkezésének fő útja: citokróm rendszer (gyorsan átalakul hidrogén-peroxiddá a piridoxamin- foszfát-oxidáz, illetve aszuperoxid dizmutáz enzimek hatására) (O2)- + (O2)- + 2H+ H2O2 + O2

10. A SZABADGYÖKÖK HATÁSA AZ EGYES LÉTFONTOSSÁGÚ MOLEKULÁKRA DNS FEHÉRJÉK Enzimek inaktivációja Deoxi guanozin REAKTÍV OXIGÉN GYÖKÖK LIPOPROTEINEK TÖBBSZÖRÖSEN TELÍTETLEN ZSÍRSAVAK LDL oxidáció Lipid peroxidáció

11. A ROS SZÜKSÉGES: • SEJTMŰKÖDÉS SZABÁLYOZÁSÁBAN • SZIGNÁL TRANSZMISSZIÓS FOLYAMATOKHOZ • SEJTOSZTÓDÁSHOZ • GYULLADÁSOS FOLYAMATOKHOZ • APOPTOZISHOZ

12. APOPTÓTIKUS SZIGNÁLOK ROS Szignál transzmisszió : death receptors (TNF superfamily) + DD (death domain) CASPASE-8 CASPASE- 3  Pro-caspase-3 MITOKONDRIUM D4-GDI (GDP dissociation inhibitor) CITOKROM C KIÁRAMLÁS CASPASE-9 AKTIVÁCIÓ SEJTMAG GTP-ÁZOK DNSFRAGMENTÁCIÓMEMBRÁN (poli-(ADP)-ribóz szint ) CITOSZKELETON VÁLTOZÁSOK SOD kiáramlás SEJTHALÁL

13. A lipid peroxidáció mechanizmusa Lipid peroxidáció (oxidativ stressz): a biológiailag aktív molekulák reakciója oxigén eredetű molekulákkal és gyökökkel A lipid peroxidáció folyamatának fő szakaszai: (1) Iniciáció: szabadgyök képződés (2) Propagáció: a szabadgyök képződés láncreakciószerű kiteljesedése (3) Termináció: (kvázi)stabil gyökök és molekulák keletkezése

14. LIPID PEROXIDÁCIÓ – OXIDATÍV STRESSZ LH (PUFA)  L L + O2- LOOH ÁTMENETI FÉMEK (VAS/RÉZ) HATÁSA LOOH + Fe(II)  Fe(III) + OH- + LO LOOH + Fe(III)  Fe(II) + H+ + LOO

15. A C-18-as zsírsavak relatív oxidációs sebessége (Varst, 2001 nyomán)

16. A MEMBRÁNOK OXIDATÍV KÁROSODÁSA

17. ANTIOXIDÁNS VÉDELEM NEM ENZIMATIKUS VÉDELEM E-VITAMIN(  - tokoferol) Hatása: biológiai membránok védelme kromángyűrű – fizikai kapcsolat a foszfolipidekkel fitil oldallánc – keresztkötések az arachidonil oldallánccal OH gyök „akció radiusa” 10-9 sec = 2-3 nm

19. Egyes tokoferol és tokotrienol vegyületek oxidáció kinetikája azobis iniciátor jelenlétében

20. C-VITAMIN(L-aszkorbinsav) HATÁSA: hidrogén donor redukáló tulajdonságú – tokoferol „regeneráció” - GSSG redukciója TOC  TQ + AH  TOC + DHA GSSG + 2AH  2GSH + 2DHA A gazdasági állatok képesek a C-vitamin szintézisére DE szintézis kapacitás  aktuális igény

22. UBIQUINON (CoQ) Hatása: szelén / E-vitamin hiány esetén antioxidáns – elektron donor Máj (hepatociták) védelme KAROTINOIDOK (β-karotin) Hatása: peroxil gyökfogó vegyület máj, ovarium (c. luteum), here (Leydig sejtek) védelme A-VITAMIN - önmagában nem antioxidáns kémiai szerkezete alapján gyökfogó hatású máj, ovarium, here védelme

23. Fémkötő (kelátképző) vegyületek Ferritin (1 mol/ 45000 vas) – az állati szervezetben Idegsejtek és máj védelme Metallothionein: Hg<Cu< Cd < Zn máj védelme (vesében felszabadul a fémion) Egyéb antioxidáns vegyületek Glutation - -Glu-Cys-Gly Hatásai: fehérjék SH csoportjainak fenntartása cisztein raktár xenobiotikum konjugáció( R + GSH  GS-R + H) minden sejttípus védelme

24. ENZIMATIKUS VÉDELEM Szuperoxid-dizmutáz Cu-Zn – citoszol Mn – mitokondrium Fe – prokarioták O2 +O2 + 2H+  H2O2 +O2 minden sejttípus védelme (mitokondrium + citoszol) Aktivitását befolyásoló tényezők: oxidatív stressz esetén emelkedik mikroelem hiány (Cu, Zn, Mn)

25. Kataláz Fe tartalmú 2H2O2  O2 + 2H2O vörösvérsejtek, fehérvérsejtek védelme Aktivitását befolyásoló tényezők: életkor (génexpressziója az öregedéssel csökken) takarmány megvonás (csökkenti az öregedés hatását)

26. Glutation-peroxidázok (aktív centruma SECIS element – szelenocisztein (TGA – UGA kodon) - Se tartalmú 2GSH + H2O2  GSSG + 2H2O Klasszikus glutation-peroxidáz (Mills, 1957) –H2O2 (VVS) Citoszol glutation-peroxidáz (Rotruck et al, 1973) - H2O2 + lipidperoxidok + koleszterol-7-;7-hidroperoxidok máj-, harántcsíkolt izmok, érfal endothel sejtek, idegsejtek Foszfolipid-hidroperoxid glutation-peroxidáz (Ursini,1985) – foszfolipid-hidroperoxidok - monomer membrán kötött enzim (madarak májában citoszol forma is) Minden sejt, spermium nukleusz GSH-Px (S-H S-S)

27. A "stem-loop" másodlagos mRNS 3' UTR szerkezet felépítésének általános sémája [Low és Berry, 1996] a.) a klasszikus glutation-peroxidáz mRNS-ében, b.) a foszfolipid és az extracelluláris glutation-peroxidáz mRNS-ében

28. A szelenocisztein beépülésének sémája eukariotákban (Berry et al., 1993)

29. Extracelluláris glutation-peroxidáz (Takahashi,1990) -H2O2 vérplazmában és szövetekben (extracelluláris térben) Vérplazma glutation-peroxidáz (Avissar et.al., 1994) - H2O2 vérplazmában (szintézise: vese tubuláris rendszerében) Gastrointestinalis glutation peroxidáz (Chu, Esworthy,1995) H2O2 + lipid peroxidok és – hidroperoxidok vékonybél epithel sejtek Mellékhere extracelluláris glutation peroxidáz (Williams, 1998) - H2O2 + lipid peroxidok és – hidroperoxidok mellékhere és szeminális plazma (spermium membrán)

30. Aktivitását befolyásoló tényezők -oxidatív stressz hatások (aktiváció  gátlás) • szöveti lokalizáció ( máj >>> agy ) • endokrin hatások (androgének, melatonin) • életkor (az ivarérésig nő, az öregedéssel csökken) • takarmányok zsírtartalma (nagy  csökken az aktivitás) • többszörösen telítetlen zsírsavak (növelik: n-6 zsírsavak) • fehérjehiányos takarmányozás csökkenti

31. - szelénhiány (csökkenti - szívizomban akár 96 %-kal is) (kivétel: agyszövet - viszonylag állandó) • szükségletet meghaladó mennyiségű szelén kiegészítés (az élettani szint elérése felett tovább már nem fokozza sem az enzimfehérje szintézisét, sem aktivitását) - E-vitamin (növeli a phGSHPx aktivitást a spermiumban)

32. 5’-dejodinázok (aktív centrum SECIS element – szelenocisztein (21.aminosav) I. típus: pajzsmirigy, máj, vese, tobozmirigy II. típus: pajzsmirigy, placenta, tobozmirigy, központi idegrendszer, újszülött rágcsálók zsírszövete III. típus: bőr, placenta, központi idegrendszer 2HI + H2O2  I2 + 2H2O Aktivitását befolyásoló tényezők Szelénhiány – csökkenti TSH – növeli

33. Glutation-S-transzferázok (specifikus GSH kötőhellyel rendelkeznek) 2GSH GST GSSG + 2H+ • szelén hiányos állapotokban aktiválódnak (nem szelén dependens glutation-peroxidázok) - hatékonyan redukálják a koleszterol-7-hidroperoxidokat • a GST A4-4 izoenzim hatékonyan redukálja a 4-hidroxi-2 nonenal-t (agyban) - phGSHPx aktivitást mutatnak

34. NÖVÉNYI EREDETŰ ANTIOXIDÁNSOK ÉTERIKUS OLAJOK ANTIOXIDÁNS VEGYÜLETEI HATÁSUK: ELEKTRON DONOR - ANTIOXIDÁNS MEMBRÁN CSATORNÁK VÉDELME (ENTEROCITÁK  FELSZÍVÓDÁS) POLIFENOLOK: FLAVONOLOK – KVERCETIN, KEMPFEROL, MIRICETIN FLAVONOK – APIGENIN, LUTEOLIN TERPÉNSZÁRMAZÉKOK : CITRÁL, CITRONELLÁL, MENTON

35. SZINTETIKUS ANTIOXIDÁNSOK HATÁSUK: • TAKARMÁNYOK ZSÍRSAVAINAK VÉDELME • TAKARMÁNYOK OXIDÁCIÓRA ÉRZÉKENY BIOLÓGIAILAG AKTÍV VEGYÜLETEINEK VÉDELME • ENTEROCITÁK VÉDELE HATÁSUKAT BEFOLYÁSOLJA: • ZSÍRSAVAK MENNYISÉGE • ZSÍRSAVAK TELÍTETLENSÉGE - GYÁRTÁSTECHNOLÓGIA

36. AZ ANTIOXIDÁNS RENDSZER HÁROM VÉDELMI VONALA AZ ÁLLATI SEJTEKBEN ELSŐ VÉDELMI VONAL a további szabadgyök képződés megelőzése ANTIOXIDÁNS ENZIMEK SZUPEROXID DIZMUTÁZ GLUTATION-PEROXIDÁZ KATALÁZ FÉMKÖTŐ FEHÉRJÉK

37. MÁSODIK VÉDELMI VONAL a láncreakció kiterjedésének megelőzéseés megállitása ZSIROLDÉKONY ANTIOXIDÁNSOK A- ÉS E-VITAMIN, KAROTINOIDOK, UBIQUINOLOK VIZOLDÉKONY ANTIOXIDÁNSOK C-VITAMIN, GLUTATION, HÚGYSAV

38. HARMADIK VÉDELMI VONAL a makromolekulák károsodott szakaszainak kivágása és helyreállitása REPAIR ENZIMEK LIPÁZOK – foszfolipáz A2 PEPTIDÁZOK – peroxiszóma enzimek PROTEÁZOK – calpainok (kalcium efflux gáltás) DNS REPAIR ENZIMEK – bázis (oxo-guanozin), nukleotid repair Glutation-reduktáz GSSG + 2NADPH  GSSG-R  2GSH + 2NADP+

39. Az oxidativ stressz kialakulása fiziológiás és patológiás folyamatok során

40. Oxidatív stressz: a prooxidáns és az antioxidáns anyagok egyensúlya eltolódik az előzőek javára Az arányeltolódást előidézheti: Külső tényezők: magas hőmérséklet – hőstressz UV sugárzás – fertőtlenítés, napfény hatása ionizáló sugárzás – fertőtlenítés

41. TAKARMÁNYOZÁSI HATÁSOK Fémtoxikózisok (réz és a vas) Cu(II) + (O2)-  Cu(I) + O2 Cu(I) + H2O2 Cu(II) + (OH) + OH- vagy NO + O2-  ONOO- + ONOOH  Cu(II) OH + NO2 vagy Fe(III) + (O2)-  Fe(II) + O2 Fe(II) + H2O2 Fe(III) + (OH) + OH Biológiai rendszerekben tiol-Fenton tipusu reakció: Fe(III) + RSH  Fe(II) + RS + H+ Fe(II) + H2O2 Fe(III) + (OH) + OH-

42. Glutation depléció Előidézheti: éhezés – baromfi fajoknál 24 óra elegendő! metionin hiány cisztein hiány A-vitamin túladagolás gátolja az E-vitamin felszívódását, illetve annak a májban való tárolását

43. A-vitamin kiegészítés hatása a máj E-vitamin tartalmára brojlercsirkében (Surai és Kuklenko, 2000 nyomán) A-vitamin kiegészítés 42 napos 56 napos (NE/kg) (g /g nedves szövet) 10 18,71 12,40 50 15,19 11,70 100 12,72 9,44 500 10,44 7,12 1000 8,19 5,11 2000 6,19 4,12

44. Nagy lipid peroxid tartalmú takarmányok felvétele: • közvetlenül kevéssé toxikus (májkárosodás, szaporodás- biológiai zavarok, tumor képződés) Peroxidált lipidek metastabil végtermékeinek hatása: Alkanalok - malondialdehid fehérjék tiol- valamint a szabad -lysil csoportjaival való kapcsolódás - LDL oxidáció Alkenalok - 4-hidroxi-nonenal elektrofil vegyületek – reakcióba lép a glutationnal, fehérjék -lysil csoportjaival. Alkánok - pentán kémiai reaktivitásuk kicsi

45. Nagy peroxid tartalmú takarmányok etetése

46. Mikotoxinok jelenléte a takarmányokban kémiailag reaktív molekulák (epoxi csoport: AFB1, T-2) Csökkentik az antioxidánsok mennyiségét: 2GSH + O2-  GSSG + H2O Nutritív antibiotikum toxikus adagja a takarmányokban gátolják a K+/Na+-ATP-áz működését  membrán csatornák zavara  Ca2+ efflux zavara  sejtanyagcsere zavara  lipid peroxidáció

48. Nutritív antibiotikum toxikus adagja a takarmányokban gátolják a K+/Na+-ATP-áz működését  membrán csatornák zavara  Ca2+ efflux zavara  „Mitochondrial swelling”  lipid peroxidáció

50. Akut vagy krónikus stressz hatások - hideg környezetvagy az immobilizáció gyökképző folyamatok intenzitása fokozódik  antioxidánsok mennyisége csökken ( pl. glutation, E-vitamin vagy aszkorbát)