1 / 82

稳定核素示踪技术

稳定核素示踪技术. 第一节. 概 述. 基本概念：. 核素： 具有特定特征的某一种原子 同位素：原子含有相同的质子数， 不同的中子数 同位素丰度：某一同位素在该元素中所占原子 百分含量 原子百分超：某同位素的标本或某标记物中， 某同位素丰度与该同位素天然丰 度之差。 分子丰度：每100个分子中带标记核素的分子 有多少。（包括了天然稳定核素

xenia
Download Presentation

稳定核素示踪技术

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 稳定核素示踪技术

  2. 第一节 概 述

  3. 基本概念： • 核素： 具有特定特征的某一种原子 • 同位素：原子含有相同的质子数， • 不同的中子数 • 同位素丰度：某一同位素在该元素中所占原子 • 百分含量 • 原子百分超：某同位素的标本或某标记物中， • 某同位素丰度与该同位素天然丰 • 度之差。 • 分子丰度：每100个分子中带标记核素的分子 • 有多少。（包括了天然稳定核素 • 形成的标记分子）

  4. 稳定核素应用历史溯源

  5. 1947年 Wisconsin大学“同位素在生物学 和医学中的应 用” • 专题讨论会，开始稳定同位素应用的新纪元 • 1947-1960S 稳定同位素技术迅速发展 • 1977年 London稳定同位素国际讨论会 • 1978年 T.A.Baillie编写会议论文集 • “Stable Isotopes:Applications in Pharmacology ,Toxicology and Clinical Research” • 稳定核素应用范围和分析技术方面： • P.D.Klein 肯定了稳定核素是生物学和医学研究中的基本工具 • J.T.Watson 报道了测定同位素的质谱方法 • G.H.Draffan 介绍了稳定同位素在人体药物代谢研究中的应用 • D.S.Davis 介绍了氘标记在克洛尼丁的药代动力学和浓度效应 • 研究中的应用 • D.M.Wilson 研究了高分辨质谱法和 MRS 对稳定同位素参入的 • 检测和定量 • 1977-1992年 稳定同位素在生物学和医学中的应用更为广泛， • 采用的核素范围更广

  6. Z X A 1 H 2 3 Li 6,7 5 B 10 6 C 13 7 N 15 8 O 17,16 12 Mg 25 16 S 33,34 20 Ca 42,44,46 24 Cr 50 Z X A 26 Fe 54,57,58 29 Cu 65 30 Zn 64,67,68,70 34 Se 74 42 Mo 95,96 50 Sn 116,120 52 Te 124,126 53 Er 170 68 I 127 生物医学中常用的稳定核素

  7. 稳定核素测定的特点: 1.无辐射危害 2.适用于长过程的示踪 3.无化学毒性 4.无半衰期足够长的放射性核素，稳定 核素是唯一示踪物 5.结合MS和MRS，可知示踪物 分子结构及具体标记位置 6.与放射性核素双重标记， 互相弥补不足

  8. 第二节 稳定核素及其标记物的测量分析

  9. 稳定核素测量分析内容 1.稳定核素的丰度 2.核质量 3.标记化合物的结构 4.示踪原子在标记分子中的位置

  10. 气 相 色 谱 法 • 色谱 • 吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组分 • 吸附性能的差异以达到分离 • 的目的。 • 分配色谱：利用不同组分在流动相和固 • 定相之间的分配系数的不同 • （溶解度的不同）。

  11. 担 体 • 担体：具有化学惰性的多孔性微粒或玻 • 璃微珠。 • 特性： 表面面积大、无吸附能力、 • 孔分布均匀、热稳定性好、 • 机械强度适宜。 • 分类： 硅藻土型担体 • 非硅藻土型担体（氟担体、玻璃微珠、素瓷）

  12. 固 定 相 • 固定剂：高分子多孔微粒，可吸附， • 可作为担体。 • （ 苯乙烯、二乙烯苯） • 固定液： 沸点高，蒸汽压低、 • 热稳定性好、溶解能力高、 • 分离能力高。 • （极性：甲基硅氧烷、苯基硅氧烷、 • 氰基硅氧烷 • 非极性：沙鱼烷、阿皮松）

  13. 气 相 色 谱 柱 • 气—固色谱柱：液态的固定相冷凝或涂 • 在管壁，又称空心柱。 • 气—液色谱柱：将固定相或担体装入厚 • 壁玻管，然后加热拉成 • 毛细管，又称填充柱。

  14. 气 相 色 谱 程 序 载气——压力调节器——净化器——稳压 阀（调节流量）——柱前压力表——转子 流量计——进样器——色谱柱——检测器 注入液 柱后分 态样品 流收集 ——记录仪

  15. 质 谱 法 定义：直接测定各种物质的原子或原子 团的质荷比，确定被测原子或原 子团的特性和数量 优点：不受待测元素种类和物质形 态的限制； 灵敏度较高；精确度好

  16. 质 谱 分 类 • 无机质谱：同位素比值质谱仪 • 有机质谱：GC-MS • LC-MS • LC-GC-MS

  17. 样品的制备 样品的电离 离子束流的出射 分离 离子束流的接受 数据处理 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 数据处理系统 质谱工作环节 质谱仪器系统

  18. 质 谱 法 • 基本原理：将气体样品或液体、固体样品的蒸汽 • 引入电离室，用离子流轰击，使样品 • 分子失去电子成为带正电的分子离子， • 再进一步裂解成更小的离子、 碎片离 • 子。离子束经过磁场， 使不同质荷比 • m/e的正离子，并记录其相对强度，绘 • 出质谱图， 进行定性、定量分析。

  19. 质 谱 仪 • 程序： • 气体分子流 碎片离子束 • 气体样品存储器———电离室————— • 加速离子束 一束正离子 • 加速室———分离管————狭缝—— • 正离子收集器——记录器（质谱图）

  20. 电 离 方 式 • 电子轰击电离：利用几十电子伏的慢电子轰击引入离子源内的 • 气体样品，使样品原子或分子失去电子形成正 • 离子，或使其捕获电子而形成负离子。 • 优点：重复性好。 • 表面电离：难以气化的固体样品原子或分子接触热金属表面产生 • 热离子发射。 • 优点：对碱金属有较好灵敏度。 • 缺点：不同元素电离效率相差大。 • 化学电离：用 电子轰击反应气体，使生成初级离子，初级离子再 • 与气体样品通过离子—分子反应，生成样品离子。 • 优点：适用多原子化合物，易获得离子峰，碎片峰少， • 谱线单纯。

  21. 质量分析器I: 双聚焦质谱

  22. 质量分析器II : 三级四级杆质谱

  23. 质量分析器III: 飞行管质谱

  24. 性 能 指 标 • 分辨率：对相邻两个质谱峰的分离能力 • 质量范围：分析样品的分子量范围 • 灵敏度：每次分析样品所需最小量 • 丰度灵敏度 • 精密度 • 准确度

  25. 核素质谱分析法的优点 • 可以分析所有同位素，气、液、固三态样品 • 精确度高 • 可与气相色谱、液相色谱仪连用，由计 算机控制 • 可以提供原子量、分子量、同位素丰度、标记化合 • 物同位素含量等多种数据

  26. 质谱用于生物活性分子研究的优点 • 很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息 • 能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定 • 准确性、易操作性、快速性及很好的普适性

  27. 蛋白质的质谱分析原理 • 通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的Ｍ/Ｚ值，分析鉴定未知蛋白质

  28. 蛋白质和肽的序列分析 • 质谱法检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI TOF MS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具。

  29. 质谱用于肽和蛋白质的序列测定方法 • 蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。 • 利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂 • 用化学探针或酶解使蛋白或肽从Ｎ端或Ｃ端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(ladder sequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。

  30. 生物大分子质谱分析软电离技术 • 1)电喷雾电离质谱 electrospray ionisation，ESI • 2)基质辅助激光解吸电离质谱 matrix assisted laser desorption/ionization， MALDI • 3)快原子轰击质谱 • 4)离子喷雾电离质谱 • 5)大气压电离质谱

  31. 假设样品分子的质量为Ｍ，而其电荷携带者的质量为Ｘ，电荷的数目为ｎ，讯号的质量电荷比为ｍ１、ｍ２等，注意讯号ｍ１的值小于ｍ２的值，且ｍ１的电荷（ｎ１）大于ｍ２的电荷（ｎ２），如果ｎ１，ｎ２只差一个电荷数 (ｎ1 = ｎ２ + 1)，那么m1，m2可表示如下： m1 = (M + (n2 + 1)X )/ (n2 + 1) (1) m2 = (M + n2X) / n2 (2) 由方程式(2)解得M: M = n2(m2 – X) (3) 将(3)代入(1)，求得n2: n2 = (m1 – X)/(m2-m1) 将n2、m1、m2及X代入(1)式或(2)式可求得分子量M。 我们可选择质谱图内其它任何一对相邻的讯号并重复以上的步骤计算出数个M值，而求得平均M值。

  32. 快原子攻击（FAB）

  33. 电喷雾电离 • 利用位于一根毛细管和质谱仪进口间的电势差生成离子，在电场的作用下产生以喷雾形式存在的带电液滴，当使用干燥气或加热时，溶剂蒸发，液体体积缩小，最终生成去溶剂化离子。 • 电喷雾电离的特征：可生成高度带电的离子而不发生碎裂

  34. 电喷雾电离

  35. 　基体辅助激光解吸电离(MALDI) • 以有紫外吸收的小分子晶体为基体，将待测物与基体相结合，可检测带电生物分子的离子。在所采用的激光波长下，基体对激光有较强吸收，而待测物对激光只有弱吸收。当激光打在基体晶体时，聚集的能量加热晶体，快速加热导致基体晶体升华而将非挥发性待测物释放到气相中。 • 基体在待测物离子化过程中还起着质子化或去质子化试剂的作用。基体引进激光解吸技术前，只有低分子量化合物能被完整引入气相；对于高分子量化合物，则无法解决其气化问题。基体的加入使除待测物—基体外的分子间相互作用减少，降低了解吸能，解决了大分子的气化问题。MALDI可允许使用一般生物缓冲液。MALDI主要生成带单电荷离子，

  36. 飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS)  • TOF MS是将多肽成分转换成离子信号，并依据质/荷比来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。 • 待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪

  37. TOF MS • TOF MS 用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(peptidemassfin-gerprinting)。 • 现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。

  38. 电子喷雾电离质谱测量法(ESI-MS) • 电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连续质量分析仪(tan-demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。

  39. electrosprayion-izationmassspectrometry • 不同质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。

  40. 核磁共振仪器 核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)是指某些有磁矩的原子核，在静磁场中由于磁矩和磁场相互作用形成一组分裂的能级，在合适频率的射频作用下，能级间发生跃迁而出现的共振现象。 核磁共振技术主要用来测定分子的化学结构，尤其是天然存在的复杂有机分子结构。从液体核磁共振中可得到多方面的结构信息，而这些信息是其它方法难以得到的。

  41. 核磁共振基本原理 • 1、原子核的自旋与原子核的磁矩 • 核磁共振研究的对象是具有磁矩的原子核。原子核是由质子和中子组成的带正电荷的粒子，其自旋运动将产生磁矩。但并非所有同位素的原子核都具有自旋运动，只有存在自旋运动的原子核才具有磁矩。

  42. 原子核的自旋运动与自旋量子数I相关。量子力学和实验均已证明，I与原子核的质量数(A)、核电荷数(Z)有关。I值为零、半整数、整数。原子核的自旋运动与自旋量子数I相关。量子力学和实验均已证明，I与原子核的质量数(A)、核电荷数(Z)有关。I值为零、半整数、整数。

  43. 中子活化 • 稳定核素在一定能量的中子、带电粒子，或者高能γ射线的照射下，经过核反应生成放射性核素，该种感生放射性核素有特定的半衰期，并放射一定特征的射线。

  44. 中子活化分析法 稳定核素中子活化后，不同核素，所生成的放射性核素及放出的的射线种类和能量也不同，而且，稳定核素越多，则生成的放射性核素越多，其射线强度也越强。这样，就可以通过对放射性核素射线能谱和强度的测量来鉴别稳定核素并测定其含量。

  45. 微型中子源反应堆

More Related