Impact des radiations UV sur les communautés
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Impact des radiations UV sur les communautés cyanobactériennes. Modèles d’étude. Synechococcus sp. WH8102 Prochlorococcus MED4. Abondants dans les eaux mésotrophes et oligotrophes Distribution verticale : peu abondant < 100 m Ecotype pélagique Génome disponible

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Slide1 l.jpg

Impact des radiations UV sur les communautés

cyanobactériennes

Modèles d’étude

Synechococcus sp. WH8102 Prochlorococcus MED4

  • Abondants dans les eaux mésotrophes et oligotrophes

  • Distribution verticale : peu abondant < 100 m

  • Ecotype pélagique

  • Génome disponible

  • Manipulable génétiquement

  • Abondants dans les eaux oligotrophes

  • Concentration : souvent > a 105 cell.ml-1

  • Distribution verticale : de 1 à 100 m

  • Ecotype de surface

  • Génome disponible

Approches

  • Etudier l’effet des UV sur la photosynthèse, le cycle cellulaire et la réparation des dommages

  • à l’ADN dans différentes conditions de culture.

  • Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la résistance aux UV (Gel 2D, Microarrays).

  • Mise au point de marqueurs du stress UV applicables en milieu naturel.


Slide2 l.jpg

Participants pour la Station Biologique de Roscoff

  • Samuel Chaffron (MST, Mise en place du Turbidostat)

  • Alexis Dufresne (Thèse, Bioinformatique)

  • Chistophe Six (Thèse, Protéomique)

  • Ludovic Chopin (DEA, Biologie Moléculaire)

  • Julia Holtzendorff (Post doc, Biologie Moléculaire)

  • Dominique Marie (IE, Cytométrie en Flux)

  • Laurence Garczarek (CR1, Biologie Moléculaire)

  • Jean-Francois Lennon (CR1, Physicien)

  • Fredéric Partensky (DR2, Coordinateur)


Slide3 l.jpg

Expériences Prévues dans le Cadre d’UVECO

  • Cyclostat en lumière jour-nuit modulée (PAR + UVA + UVB)

  • Microarrays : Complet et/ou miniarray (environ 150 gènes)

    • Gènes photosynthétiques : Centres Réactionnels, Phycobilisomes, Synthèse des pigments (chlorophylle, caroténoides), Gènes de stress lumineux (HLIP)

    • Réparation des dommages à l’ADN

    • Antioxydants

    • Protéines Heat shock

    • Systèmes à deux composants

    • Transcription/Machinerie régulatoire

    • Fixation du carbone

    • Intégrité membranaire

    • Synthèse protéique

  • Expérience de shift ou acclimatation de Synechococcus à différentes lumières (UVA, B)

  • Genétique sur Synechococcus(Mutants ponctuels, librairies de mutants)

  • Biosenseur en temps réel (utilisant le gène recA ?)


Slide4 l.jpg

1500 μE

Niveau

d’éclairement

x

x

x

0

18

18

6

18

6

18

6

18

6

Temps (heures)

UVA

UVB

PAR

Photodiodes

Construction du Cyclostat

MILIEU DE CULTURE

Pompes

péristaltiques

UVA, UVB

PRELEVEMENTS

PAR

POUBELLE

CULTURE


Slide5 l.jpg

x

x

x

Construction du Cyclostat

MILIEU DE CULTURE

Bain circulant Thermostaté

Pompes

péristaltiques

Prélèvement automatique

des échantillons

POUBELLE

CULTURE


Slide6 l.jpg

Paramètres étudiés à partir du Cyclostat

  • Cytométrie en Flux :

    • Croissance et cycle cellulaire

    • Formation intracellulaire de composés d’oxygène réactifs ?

  • Gels 2D

    • Identification de protéines différentiellement exprimées

  • PCR Quantitative

    • Expression de différents gènes impliqués dans la photosynthèse, la photoprotection, le cycle cellulaire et la formation de dommage à l’ADN

  • Microarrays (Mise en évidence de nouveaux gènes impliqués dans la résistance aux UV)

  • Péroxydation des lipides membranaires (dosage a l’acide thiobarbiturique)

  • Dosage des groupements -SH(C. Six)

  • Composition pigmentaire (HPLC, spectrofluorimétrie,C. Six, F. Lantoine)

  • Variation des paramètres photosynthétiques (P. Conan) ?

  • Dommages à l’ADN (dosage des CDPs,F. Joux)

  • Modifications biochimiques (sucres, acides aminés,R. Sempéré)


Slide7 l.jpg

18:00

6:00

18:00

6:00

Volumes prélevés et fréquence des prélèvements sur le cyclostat

Méthodes d'analyses Volumes Prélevés

Cytométrie en Flux(D. Marie)

Croissance, cycle cellulaire, 2 x 1 ml

Espèces réactives de l'O2 toutes les 30 min

Analyse pigmentaire(C. Six, F. Lantoine)

HPLC 3 x 50 ml

Spectrofluorimétrie 1.5 ml

Mycosporines ?

Paramètres photosynthétiques(P. Conan)?

ARN(L. Garczarek)

Microarrays + PCR Q 700 ml

Gels 2D (C. Six)2 ou 3 points/jour

Exp indép

Groupements –SH(C. Six) ?

Dimères de thymidine/

Protéines carbonylées(F. Joux) ?

Dommages lipidiques(C. Six ou F. Joux) ?

Malondialdehyde

Modifications Biochimiques(R. Sempéré) ?

Sucres, acides aminés

1500

Growth irradiance

(µE.m-2.s-1)

750

0

Time

Points de prélèvement

6h, 9h, 12h, 15h, 18h, 22h, 2h

Volume Maximum prélevé = 900 ml/ point


Slide8 l.jpg

Calendrier récapitulatif

2003

2004

2005

2006


Slide12 l.jpg

Macroarray Gene Selection

  • Model : Synechococcus WH8102

  • 2 Arrays : Photosynthesis/Photoprotection/UV stress

  • Small ORF in Synechococcus (< 100 Amino Acid)

  • Structure : Hybridization/Scanning :

  • Genopole Grand Ouest (Plateform of Rennes)

  • Laboratory of Frédérique Hubler

  • Bioinformatic/Statistic Treatment :

  • Genopole Grand Ouest (plateform of Nantes)

  • Conditions : First array limited to 100-150 genes

  • Oligonucleotide/PCR product ?

  • Control:Stress: Cy3/Cy5


Slide13 l.jpg

  • Photosynthetic genes Gene Name

  • 1 photosystem II D1 protein form II psbA2

  • 2 photosystem II D2 protein psbD1

  • photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein subunit psaA

  • Ia (PsaA)

  • 4 photosystem II chlorophyll-binding protein CP43 psbC

  • 5 photosystem II chlorophyll-binding protein CP47 psbB

Phycobilisomes

Phycoerythrin

Allophycocyanin

Phycocyanin

Stroma

CP47

CP47

D2

D2

Thylacoïdale

Membrane

D1

PsaA

PsaB

CP43

D1

CP43

D1

Lumen

PsaI/L

PsaF/J

PsaM

CR II

CR I

Photosystem I

Photosystem II


Slide14 l.jpg

Pigment synthesis Gene name

6 chlorophyll synthase 33 kD subunit chlG

7 possible light-dependent protochlorophyllide oxido-reductase pcr, por

8 light-independent protochlorophyllide reductase subunit B chlB

9 lycopene beta cyclase crtL

10 beta-carotene hydroxylase crtR

11 carotenoid binding protein or0312

12 possible beta-carotene ketolase or0313

13 conserved hypothetical protein or0315

Chlorophyll synthesis Carotenoids synthesis

DV-Protochlorophyllide a2

lycopene

lycopene β cyclase

Protochlorophyllide

oxydoreductase

(or0543, or0791, or1537)

Protochlorophyllide reductase

(or0544, or0545, or0545)

γ-carotene

lycopene β cyclase

β-carotene

Chlorophyllide a2

β-carotene hydroxylase

β-cryptoxanthin

Chlorophyll synthase

β-carotene hydroxylase

Chlorophyll a2

zeaxanthin