La modulation de l’apoptose dépendante du récepteur Fas :

1. La modulation de l’apoptose dépendante du récepteur Fas : Étude des événements précoces de la voie de signalisation apoptotique dans un modèle de lymphocytes T humains. Marie Bénéteau UMR CNRS 5164 Bordeaux Pr Jean-François Moreau Directeur de thèse : Jean-Luc Taupin Présentation Nice 08/03/07

2. Fas N 1 PLAD CRD1 66 DISC FADD CRD2 112 CRD3 149 Voie de type II Caspase 8 c-FLIPL c-FLIPS 214 DM 298 C Voie de type I Apaf-1 317 Cytochrome c Apoptosome Caspase 9 Caspase 3 APOPTOSE Introduction : le récepteur Fas et sa voie de signalisation apoptotique Itoh et al., Cell, 1991. Oehm et al., J Biol Chem, 1992. Mutations du gène Fas Maladies auto-immunes (ALPS) Cancers (lymphomes) D’après Bidère et al., Annul Rev Immunol, 2006

3. Legembre et al., Mol Cell Biol, 2005. Legembre et al., J Immunol, 2006. Introduction : le récepteur Fas et les microdomaines membranaires Implication des microdomaines dans le signal Fas Muppidi et Siegel, Nature Immunol, 2004. Microdomaines : Zones compactes flottant dans la membrane plasmique Enrichies en certains lipides et protéines Voie de type I Voie de type II APOPTOSE

4. Problématique : Étude des événements précoces de la voie de signalisation apoptotique I II

5. I. De la résistance à l’anticorps agoniste et de l’implication de c-FLIP Dominant-negative Fas mutation is reversed by down-expression of c-FLIP.Cancer Res. 2007 Jan 1;67(1):108-15.

6. 100 80 60 % cellules mortes IgFasL 40 7C11 20 0 0,1 1 10 100 1000 Concentration (ng/ml) 5% Sélection de cellules résistantes JKR#2 Constatation : différence anticorps agoniste et ligand de Fas FasL IgM anti-Fas Fas Cellule Jurkat Maximum d’apoptose 95% 100%

7. I. 1. Sélection de cellules résistantes Sensibilité à différents activateurs de Fas 7C11 IgFasL JK77 100 100 JKR#2 80 80 60 60 % cellules mortes 40 40 20 20 0 0 0 100 200 300 400 0 100 200 300 400 Concentration (ng/ml) Concentration (ng/ml) Résistance aux anticorps agonistes. Sensibilité maintenue mais diminuée au FasL. • Pas de modification de la quantité de Fas à la membrane. • Pas de différence de quantité des protéines de la voie de signalisation apoptotique. • Pas d’activation de la caspase 8 dans les Jurkat R traitées par le 7C11

8. I. 2. Analyse de la résistance 2.1. Séquence du récepteur Fas EAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKK a3 a4 a5 mutant DTAEQKVQLL normal DTAEKKVQLL Huang et al., Nature, 1996. Présence d’une mutation au statut hétérozygote dans le domaine de mort : Q257K

9. Anti-Fas Isotype 100 100 80 80 60 60 % cellules mortes 40 WR19L 40 sFasL 7C11 20 WR19L Fas 20 WR19L FasQ257K 0 0 50 100 150 0 0 200 400 Concentration (ng/ml) I. 2. Analyse de la résistance 2.2. Conséquences de la mutation Q257K WR19L Jurkat Splénocytes murins Marquage Fas murin Cellules parent Méthode : transfection des WR19L Nombre de cellules Nombre de cellules contrôle Fas FasQ257K Marquage Fas humain Transfection WR19L Intensité de fluorescence Dans un contexte homozygote, le Fas Q257K ne transmet aucun signal apoptotique. Dans un contexte hétérozygote, résistance à l’apoptose plus marquée avec l’anticorps qu’avec FasL et selon le niveau d’expression de la forme mutée. > Mutation responsable du phénomène de résistance.

10. 7C11 Normal Mutant c-FLIP Hypothèse : seuil de sensibilité Fas FADD Caspase 8 ARN interférent Apoptose Apoptose Apoptose

11. Transfection stable 80 7C11 60 Jurkat-R/ ARNi contrôle Jurkat-R/ ARNi FLIP #1 % ADN fragmenté 40 Jurkat-R/ ARNi FLIP #2 20 Jurkat-R C ARNi 0 FLIPL - 0 100 200 300 400 Concentration (ng/ml) FLIPs - Casp-8 100 II. 3. Restauration de la sensibilité Inhibition de c-FLIP : analyse de la sensibilité à l’apoptose Méthode : ARN interférent L’inhibition de c-FLIP restaure la sensibilité à l’apoptose. (restaure l’activation des caspases et la formation du DISC)

12. 7C11 Normal Mutant Conclusion et perspectives (I) : Différences entre anticorps agoniste et FasL Seuil d’activation du récepteur Fas Agrégation versus conformation Agrégation nécessaire : - Anticorps agoniste IgM ou IgG3 - FasL soluble multimérique Conformation importante : Anticorps agoniste ne joue pas sur la conformation. Implication dans la physio-pathologie des ALPS : Syndrome multi-factoriel • Perspectives : • Sensibilisation par d’autres molécules ? Ex. :banques de molécules chimiques • Accessibilité de c-FLIP au DISC ? Immunoprécipitation • - ultracentrifugation sur gradient de saccharose • - microscopie à fluorescence

13. II. De la relocalisation de Fas dans les microdomaines par l’inhibition de la PI3K

14. 1. L’édelfosine induit un signal de mort dépendant de Fas et impliquant les microdomaines. Edelfosine Gajate et Mollinedo, Blood, 2001. PIP2 PIP3 LY294002 Wortmannine 2. - + - + P p85 p110 P-Akt PI3K Akt Voie PI3K Edelfosine ? - + • Question : L’inhibition de la PI3K induit la relocalisation de Fas dans les microdomaines ? • Apoptose induite par inhibition de la PI3K (LY294002 et wortmannine) • Localisation de Fas par rapport aux microdomaines AKT P AKT P Le récepteur Fas et la voie PI3K L’édelfosine est un inhibiteur de la PI3K.

15. Type II Type I CEM JK H9 Type II P-Akt H9 (Type I) CEM Jurkat 70 100 Edelfosine LY294002 Akt 60 80 50 60 40 % cellules mortes 30 40 20 20 10 0 0 0 20 40 60 80 100 120 0 2 4 6 8 10 12 concentration (µg/ml) (µM) II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K Spécificité de l’inhibition L’inhibition de la PI3K conduit à la mort cellulaire, préférentiellement dans les cellules de type II.

16. 60 40 40 % ADN fragmenté 20 100 sFasL 20 80 LY294002 Wortmannine 60 % cellules mortes 0 0 40 0 10 20 0 10 20 30 Concentration (µM) 20 0 0 20 40 60 Jurkat Jurkat FasQ257K concentration (ng/ml) 60 60 Isotype Fas CEM 40 40 % Cellules mortes CEM IRC CEM 20 20 Nombre de cellules LY294002 Wortmannine 0 0 CEM IRC 0 20 40 60 0 5 10 15 20 25 concentration (µM) Intensité de fluorescence II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K Analyse de la sensibilité de cellules déficientes en Fas Le signal de mort nécessite une voie Fas fonctionnelle.

17. Contrôle Contrôle Anti-Fas Anti-FasL 100 120 100 80 80 60 60 % cellules mortes 40 40 20 20 0 0 sFasL sFasL Edelfosine LY294002 Edelfosine LY294002 II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K Analyse de l’interaction entre Fas et FasL Méthode : anticorps bloquants Le signal de mort est indépendant : - de l’expression de FasL - de l’interaction entre Fas et FasL.

18. CTX-FITC PIP2 PIP3 PI3K p85 p110 Anticorps anti-Fas AlexaRed P AKT P AKT P Hypothèse : l’inhibition de la PI3K permet la relocalisation de Fas dans les microdomaines Méthode : Immunofluorescence Edelfosine LY294002 Wortmannine

19. Edelfosine LY294002 Wortmannine Microdomaines Fas Superposition Technique : Linescann Contrôle Intensité de fluorescence Distance (unités arbitraires) II. 2. Localisation de Fas et des microdomaines IECB F De Giorgi et F Ichas L’inhibition de la PI3K induit la colocalisation de Fas et des microdomaines.

20. Edelfosine LY294002, Wortmannine Restimulation TCR Conclusion (II) : 1 PI3K Voie de type II 2 Voie de type I Activation de la transcription APOPTOSE

21. 2. Implication de l’ezrine comme • adaptateur entre Fas et actine : • Utilisation de formes tronquées de l’ezrine • Mise en évidence du domaine de liaison • à l’ezrine dans le récepteur Fas. Fas Ezrine Actine Perspectives 1. Inhibition spécifique de la PI3K ? - Utilisation de formes inhibitrices de la p85 (cellules de type II) - Utilisation de formes constitutivement actives de la p110 (cellules de type I)

23. Des agrégats de haut poids moléculaire du récepteur Fas Journal of Immunology, 2003 Cutting Edge: SDS-Stable Fas Microaggregates: An Early Event of Fas Activation Occurring with Agonistic Anti-Fas Antibody but Not with Fas Ligand Patrick Legembre, Marie Beneteau, Sophie Daburon, Jean-François Moreau, and Jean-Luc Taupin.

24. 250 Agrégats Fas Les agrégats de Fas Constatation : présence de formes de haut poids moléculaire de Fas. JK 77 + anticorps agoniste C 0 15  30 60 90 120 180 Temps (minutes) 50 Monomère Fas Caractéristiques : - résistants aux SDS et au b-mercapto-éthanol, - résistants à la dénaturation thermique.

25. Questions : 1. Apparition avec le FasL ? 2. Corrélation à l’apoptose ? 3. Limitation aux cellules Jurkat ? ?

26. % apoptose Les agrégats de Fas 1. Dans les cellules Jurkat stimulées par différents activateurs C 7C11 C IgFasL C 1A12 Temps (h) 30,25 0,5 1 1,5 2 3 3 0,25 0,5 1 1,5 2 3 6 0,5 1,5 3 4,5 6 250 50 L’apparition des agrégats de Fas : - est due à l’anticorps agoniste - n’est pas indispensable à l’apoptose.

27. IgFasL IgFasL IgFasL C 7C11 C 7C11 C 7C11 Temps (h) 5 0,5 2 5 0 0,5 2 5 5 0,5 2 5 0 0,5 2 5 5 0,5 2 5 0 0,5 2 5 250 50 % apoptose Les agrégats de Fas 2. Dans plusieurs lignées lymphocytaires CEM SKW6.4 H9 Type II Type I Observation du même phénomène quelque soit les lignées testées.

28. IgFasL C 7C11 IgFasL C 7C11 Temps (h) 5 0,5 2 5 0 0,52 5 5 0,52 5 0 0,52 5 % apoptose Les agrégats de Fas 3. Dans les lymphocytes sanguins Lymphocytes non activés Activés Dans les lymphocytes, les agrégats apparaissent de la même manière et ne sont pas corrélés avec l’apoptose.

29. Conclusion • La formation des agrégats de Fas résistants au SDS dans la lignée cellulaire Jurkat est induite par l’anticorps agoniste mais pas par le FasL, qu’il soit sous forme soluble ou membranaire. • Les mêmes résultats sont obtenus avec plusieurs lignées lymphocytaires et les lymphocytes sanguins. • L’anticorps agoniste et le FasL fonctionnent différemment.

31. P-Akt Akt Temps (jours) 0 1 2 3 4 5 Isolement PHA IL2 Lymphocytes et PI3K Analyse de la voie PI3K au cours de l’activation Restimulation Type II Type I Restimulation du TCR

32. C Anti-CD3 30 0 6 0,5 1 3 6 h 20 P-Akt % ADN fragmenté Akt 10 1 0 CD3 C 0,8 ratio P-AKT/AKT 0,6 0,4 0,2 0 2 4 6 Incubation (heures) Lymphocytes et PI3K Analyse de la voie PI3K au cours de la restimulation La restimulation du TCR inhibe la voie PI3K.