生物化学实验

生物化学实验 血浆蛋白醋酸纤维薄膜电泳

一、实验操作 二、实验原理三、实验报告要求四、实验基本操作的训练

一、实验操作 分组：2人/组：点样血清 1．安置电泳槽 2．薄膜预处理 3．点样 4．电泳 5．染色 6．漂洗 7．定量

1．安置电泳槽 （1）于两侧电泳槽穴中各倒入缓冲液约800ml。（2）平衡两侧电泳槽穴的缓冲液。（3）搭建盐桥。

2．薄膜预处理 洗净手，在醋酸纤维素膜的粗面（无光泽）上，于图示位置即2.0cm处轻轻用铅笔划一直线，另一端上写上姓名。将作好标记的醋酸纤维素膜浸于培养皿缓冲液中，待完全浸透10min后，取出夹于滤纸中，轻轻吸去膜上多余缓冲液。

注意：样品易太多 3．点样分别用6mm宽载玻片边缘蘸5ul血清蛋白，点样于10cm×5cm醋酸纤维素膜的点样线上。见图2。

4．电泳 （1）将薄膜上的点样面向下，点样端置阴极，并贴于盐桥上，密闭电泳槽。（2）用导线与电泳仪相连接，注意电泳仪电源负极接电泳槽的阴极，正极接电泳槽的阳极，不要接错。（3）接通整流器电源，打开整流器电源开关。调节电泳仪输出电压为130V之间，电流为0.4～0.6mA／cm，通电60分钟后关闭电源。

5．染色 关闭电源后，将薄膜取出，置于染液3～5分钟。 6．漂洗从染液中取出薄膜，用自来水冲去多余染料后，置于脱色摇床中漂洗，直到薄膜本底呈白色，蛋白质色带清晰，最后再清水中漂洗1次。凉干。

2 清蛋白透明前清蛋白 1   扫描、定量兔血清蛋白电泳

二、基本原理 带电粒子在电场中向电性相反的方向移动的现象称为电泳。电泳过程中带电粒子的动力为电场力，其大小与粒子所带的电荷（Q）和电场强度（X）成正比。一球形粒子运动时所受到的阻力可由stoke氏定律描述，即：

当二者平衡时即F＝f，粒子在介质中恒速运动，若将单位电场强度下粒子的运动速度（V/X）定义为迁移率（mobility），以u表示，则：当二者平衡时即F＝f，粒子在介质中恒速运动，若将单位电场强度下粒子的运动速度（V/X）定义为迁移率（mobility），以u表示，则：式中，r：球形粒子半径，η：介质粘度，V：粒子运动速度。由上式可见，粒子的迁移率在一定条件下取决于其本身的性质，即电荷、大小、形状。在具体实验中，一定的电压和电泳时间下，各种粒子在介质中的迁移率不同（泳动速度不同）而被分离。

130V，60min 血浆蛋白-/pH8.6 γ、β、α2、α1、白蛋白染色、洗脱 +五条区带

电泳方向 电泳方向电渗方向（+）（-）支持物固体液相 ++++++++++++++++++++++++ 影响电泳的主要因素 1．电渗作用在电场中，液体对固体支持物的相对移动称为电渗。即固体支持物吸附水中离子使其表面溶液相对带电荷，在电场作用下，溶液就向一定方向移动，并带动着物质移动。由于电渗与电泳同时存在，其方向可与电泳相同或相反，则会影响粒子的本身的迁移率。

2．介质的pH 介质的pH可决定带电粒子解离程度，所带电量、电荷性质，为保持介质pH的稳定，常采用一定的缓冲液。介质的pH与待电泳物的等电点相差越远，其所带的净电荷越多，则泳动速度越快。

3．离子强度 离子强度计算公式：式中，Ci：离子摩尔浓度，Zi：离子价数离子强度过低，则缓冲液容量小，难以维持pH恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。最适离子强度一般在0.02～0.2之间。

4．电场强度 即单位距离的电位差，与电泳的速度成正比，在介质一定时，其取决于电压的大小，电压越高电泳速度越快，但产生热量增加，可致缓冲液蒸发，介质离子强度增加，引起虹吸现象，其致使蛋白质变性而不能分离，因而在高压电泳（＞50伏特／cm）时，需加冷却装置。

  清蛋白 1 2   三、实验报告要求 ⒈实验名称 ⒉原理：文字简式或反应结构式表示 ⒊操作流程：列表 ⒋结果要求：区带标识

四、实验基本操作的训练 1、移液枪如何使用？（1）固定式移液枪如何使用？（2）可调式移液枪如何使用？ 2．刻度吸管如何使用？ 3、玻璃器皿如何清洁？ 4、试剂瓶用后如何使用放置？

生物化学实验

生物化学实验

Presentation Transcript