The genomic era: Past, Present and Future

1. Εμβιομηχανική και Βιοϊατρική Τεχνολογία Ακαδημαϊκό Έτος 2013-2014 The genomic era: Past, Present and Future Μέλη ομάδας: Βασιλόπουλος Βασίλειος Καναβάρης Βασίλειος Υπεύθυνος καθηγητής: Λ. Αλεξόπουλος

2. Ιστορική Αναδρομή (1) • Λήξη του Β’ Παγκοσμίου Πολέμου: • Χρήση ραδιοϊσοτόπων για την αποσαφήνιση της μεταβολικής διεργασίας (Robertset al.) • Καθιέρωση Ε. Coli ως οργανισμού – πρότυπο για βιολογικές μελέτες • Αναγνώριση ενζύμων και διαδικασιών εμπλεκόμενων με την σύνθεση μεταβολιτών • Γύρω στο 1950: • Πλήρης ορισμός βιοσυνθετικών διεργασιών για την ανάπτυξη βιολογικών μακρομορίων (π.χ πρωτεϊνες) • Ανακάλυψη μηχανισμών για την ρύθμιση του μεταβολισμού (π.χ μελέτη της δραστηριότητας των ενζύμων)

3. Ιστορική Αναδρομή (2) • 1955: • Περιγραφή της δομής της έλικας του DNA από τους Watson και Crick • Ανακάλυψη μηχανισμών αντιγραφής του DNA και σύνθεσης πρωτεϊνών • 1961: • Θεμελίωση βασικών μηχανισμών γονιδιακής έκφρασης (Jacob – Monod) • Ανακάλυψη ενζύμων ικανών να κόβουν και να συνδέουν DNA (Nathans και Smith)

4. Ιστορική Αναδρομή (3) • 1972: • Ανάπτυξη του πρώτου εργαστηριακού ζωικού ιού από τον Paul Berg στο Stanford U. • 1972 – 1984: • Ανάπτυξη μεθόδων αλυσωτής αντίδρασης πολυμερισμού (PCR – Polymerase Chain Reaction) • Εμφάνιση μεθοδολογιών DNA Sequencing: Χρήση των τεχνολογιών PCR για την προσθήκη ποσοτήτων DNA σε αρχικές ποσότητες γενετικού υλικού

5. Ιστορική Αναδρομή (4) • 1984 - 1986: • Χαρτογράφηση γονιδιωμάτων διάφορων μικροβίων και βακτηριοφάγων • Πρωτοβουλία για την υλοποίηση της χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος (Santa Fe του New Mexico) • 1988 - 1989: • Μελέτη με τίτλο «Χαρτογράφηση και Αποτύπωση του Ανθρώπινου Γονιδιώματος» • Ίδρυση Εθνικού Κέντρου Ερευνών Ανθρώπινου Γονιδιώματος στην Αμερική

6. Ιστορική Αναδρομή (5) • 1991:Ανάπτυξη μεθόδου για εύρεση γονιδίων χωρίς την απαίτηση μέτρησης ολόκληρου του γονιδιώματος (Craig Venter): Στήριξη στην έκφραση των γονιδίων μέσω του mRNA και κατασκευή συμπληρωματικού DNA (cDNA) • 1991-1995: Απομόνωση πάνω από 170.000 τμημάτων cDNAκαι αναγνώριση περίπου των μισών γονιδίων του ανθρώπινου γονιδιώματος

7. Ιστορική Αναδρομή (6) • 1998: • Human Genome Program: Ανακοίνωση πλάνου για ολοκλήρωση της αποτύπωσης του ανθρώπινου DNA ως το 2003 • Βασικοί στόχοι: α) Κάλυψη 90% του γονιδιώματος, β) Ελεύθερη πρόσβαση στις βάσεις δεδομένων από όλους • 26 Ιουνίου 2000: • Συνάντηση των Collins και Venter με τον πρόεδρο Clinton • Ολοκλήρωση του προγράμματος 3 χρόνια πριν το αναμενόμενο – Δημοσίευση στο «Science and Nature» το 2001

8. Βασική μέθοδος DNA Sequencing • Βασικά βήματα DNA Sequencing: • Fragmentation: Σπάσιμο του γονιδιώματος σε δείγματα λίγων εκατοντάδων βάσεων • Isolation: Προσεκτική λήψη των δειγμάτων ώστε να διατηρούν το σήμα τους • Amplification: Ενίσχυση του σήματος για αύξηση της ακρίβειας των μετρήσεων • Readout: Μετατροπή του σήματος των βάσεων σε μορφή που διαβάζεται από μηχανή (συνήθως σε οπτικό σήμα) • π.χ Illumina Genome Analyzer – Hiseq Systems

9. Fragmentation – Isolation • Κόψιμο δείγματος DNA σε τμήματα περίπου 400 ζευγών βάσεων • Προσκόλληση ολιγονουκλεοτιδίων (μικρού μήκους νουκλεϊκά οξέα) στα άκρα – «λαβές» για κάθε δείγμα • Εισαγωγή του δείγματος σε κύτταρο ροής με «τάπητα» από ολιγονουκλεοτίδια • Παγίδευση του δείγματος στο κύτταρο ροής λόγω συνδέσεων των προσαρμογέων από ολιγονουκλεοτίδια • Προσκόλληση κάθε αλυσίδας DNA σε συγκεκριμένη θέσηώστε να επιτευχθεί isolation

10. Amplification • Χρήση της αλυσωτής αντίδρασης πολυμερισμού (PCR) για ενίσχυση του σήματος • Εξέλιξη κάθε τμήματος DNA σε cluster από χιλιάδες ταυτόσημα αντίγραφα της συγκεκριμένης αλυσίδας • Δημιουργία εκατομμυρίων ανεξάρτητων ομάδων στο κύτταρο ροής

11. Readout • Σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας από «χρωματισμένα» νουκλεοτίδια A,T,G,C • Απεικόνιση του κυττάρου μετά την ενσωμάτωση κάθε νουκλεοτιδίου • Διαφορετικός χρωματισμός κάθε cluster ανάλογα με το νουκλεοτίδιο που ενσωματώθηκε • Επανάληψη του κύκλου readout – κάθε νουκλεοτίδιο που προστίθεται διαθέτει «τερματικό»

12. DNA Sequencing cost

13. Next Generation Sequencing-NGS(1) Βασικά χαρακτηριστικά των NGS: • Παραγωγή τεράστιων ποσοτήτων δεδομένων σε λίγο χρόνο: • Επέκταση δυνατοτήτων: Αύξηση του αριθμού των αντιδράσεων ανά δείγμα DNA • Δημιουργία εκατοντάδων Gb (gigabases) δεδομένων με ένα και μόνο τρέξιμο • 1000 φορές περισσότερα δεδομένα σε σχέση με την απλή διαδικασία DNA Sequencing • Μέτρηση 5 ανθρώπινων γονιδιωμάτων σε μια βδομάδα με λιγότερο από 5000$.

14. Next Generation Sequencing-NGS(2) • Multiplexing:Δυνατότητα μέτρησης πολλών δειγμάτων σε ένα πείραμαμε χρήση barcodes • Εκτίμηση της δραστηριότητας του RNA με μεγαλύτερη ακρίβεια • Ρυθμιζόμενη ανάλυση: Ρύθμιση overlap (αριθμός αναγνώσεων για την μέτρηση κάθε βάσης) ανάλογα με τις ανάγκες σε ακρίβεια

15. Next Generation Sequencing-NGS(3) • Whole-Genome Sequencing: • Παροχή δυνατότητας μέτρησης ολόκληρου του γονιδιώματος ενός οργανισμού σε ελάχιστο χρονικό διάστημα (εφαρμογή σε μεγάλης κλίμακας γονιδιώματα, όπως τα ανθρώπινα, αλλά και σε μικρά γονιδιώματα βακτηρίων και ιών) • Targeted Sequencing: • Μέτρηση μόνο συγκεκριμένων περιοχών στο γονιδίωμα • Ωφέλεια σε κόστος και χρόνο • Δυνατότητα ταυτοποίησης γενετικής διαφοροποίησης • Δυνατότητα ανίχνευσης γενετικών μεταβλητών που χάνονται με την παραδοσιακή μέθοδο DNA Sequencing

16. NGS μέθοδοι • PolonySequencing • Illumina Sequencing • SOLID Sequencing • DNA nanoball sequencing • Helioscope single molecule sequencing • Nanopore DNA sequencing

17. Τύποι γονιδιωματικών ομάδων δεδομένων (1) • Sequence Variation Data: • Γενετικές διαφοροποιήσεις όπως εκδηλώνονται στην αλληλουχία αμινοξέων των πρωτεϊνών • Προσεγγίσεις για την ταξινόμηση των γενετικών διαφοροποιήσεων: • SNP Genotyping Arrays: Χρήση συγκεκριμένης αλληλουχίας βάσεων (SNP array) • Resequencing: Σύγκριση με «πρότυπο» γονιδίωμα

18. Τύποι γονιδιωματικών ομάδων δεδομένων (2) • Transcriptomic Data: • Δεδομένα που σχετίζονται με την μετατροπή του DNA σε RNA • Αναγνώριση: α) πρόωροι ή μεταγενέστεροι τερματισμοί της αλληλουχίας αμινοξέων, β) συγχώνευση γονιδίων, γ) τάξεις RNA που δεν μετατρέπονται σε πρωτεϊνες • Epigenomic data: Πληροφορίες σχετικά με τις επιγενετικές τροποποιήσεις (αλλαγές στο DNA που επηρεάζουν την δομή των πρωτεϊνών) • Interactomedata:Μελέτη αλληλεπίδρασης DNA- πρωτεϊνών, RNA- πρωτεϊνών, πρωτεϊνών- πρωτεϊνών.

19. Προγράμματα συνεργασίας • Προγράμματα ανάλυσης και συνδυασμού δεδομένων: • Roadmap Epigenomics Project • ENCODE Project • Cancer Genome Atlas • Προγράμματα δημιουργίας επι-γονιδιωματικών χαρτών(τόσο για τον άνθρωπο όσο και για άλλους οργανισμούς) – αποτύπωσης ρυθμιστικών για τον μεταβολισμό στοιχείων: • Roadmap EpigenomeConsortium • ENCODE Consortium (χαρτογράφηση πρωτεϊνικών τροποποιήσεων) • ModENCODE Consortium (για Drosophila και σκουλήκια) • ENCODE project (για ποντίκια) • Online εργαλεία για συνδυαστική ανάλυση:Galaxy, DAVID κλπ.

20. Προβλήματα στην εφαρμογή των genomics • Για τον επιστήμονα: • Καταιγισμός δεδομένων • Ελλιπή εργαλεία συνδυαστικής ανάλυσης • Δυσχέρεια στην ανίχνευση γονιδιωματικών δεδομένων καλής ποιότητας (χρήση Genome Browsers όπως ο Entrez Genomeγια αυτόν τον λόγο) • Βιο-πληροφοριακά (bio-informative) εμπόδια: • Προβλήματα στην διαχείριση των αποτελεσμάτων μεθόδων NGS

21. Μελλοντικές προοπτικές (1) • Βελτίωση της ακρίβειας των διαγνώσεων: • Βελτίωση αξιοπιστίας μετρήσεων ακόμα και από πολύ μικρό δείγμα DNA • Δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων για ασθένειες από δείγματα FFPE (αποθηκευμένα σε βιβλιοθήκες τμήματα DNA ιστών) τα οποία σήμερα υφίστανται σημαντική αλλοίωση, λόγω προετοιμασίας, χρωματισμού και αποθήκευσης • Μείωση της ευαισθησίας του δείγματος σε θόρυβο: • Εισαγωγή θορύβου λόγω π.χ του εδάφους, του θαλασσινού νερού ή του ανθρώπινου εντέρου

22. Μελλοντικές προοπτικές (2) • Περαιτέρω μείωση του κόστους: • Το κόστος ανάλυσης ενός γονιδιώματος σε λίγα χρόνια αναμένεται να γίνει ίσο με το σημερινό κόστος ανάλυσης ενός μόνο γονιδίου • Ανάπτυξη γονιδιακών φαρμάκων με συνεισφορά: • στην φαρμακευτική μέσω μείωσης των χρόνων έρευνας και έγκρισης νέων φαρμάκων • στην γεωργία • στην διάγνωση και θεραπεία ασθενειών όπως ο καρκίνος

23. Προκλήσεις • Τεχνικές προκλήσεις: • Μείωση του χρόνου προετοιμασίας του δείγματος για εισαγωγή στην εκάστοτε μηχανή • Μεταφορά των αποτελεσμάτων γονιδιωματικής ανάλυσης από τοπικούς υπολογιστές σε cloud • Μη τεχνικές προκλήσεις – Ηθικά διλήμματα: • Θα έπρεπε ασφαλιστικές εταιρίες να έχουν πρόσβαση σε γονιδιωματικές πληροφορίες; • Τι επίδραση θα έχει η διάγνωση ότι ένα άτομο είναι πολύ πιθανό να εμφανίσει κάποια ασθένεια στο μέλλον στο ίδιο το άτομο και στην οικογένειά του; • Germline Therapy (εισαγωγή συγκεκριμένων γενετικών χαρακτηριστικών π.χ σε αυγά) – Ποιος αποφασίζει ποια γενετικά χαρακτηριστικά είναι επιθυμητά και ποια όχι;

24. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ

25. Σας ευχαριστούμε!