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酶工程（二）

酶工程（二）. 四、酶催化反应机理及反应动力学. （二）酶的催化反应机理. 1 酶的活性中心 指酶分子中直接和底物结合，并和酶的催化作用直接有关的部位。 （ 1 ）结合基团：与 S 结合的基团。 （ 2 ）催化基团：直接参与催化反应的基团。 酶的活性部位，不仅决定酶的专一性，同时对 E 的催化性质起决定作用。 活性部位的基团都是必需基团，必需基团还包括活性部位以外的，对维持空间构象必需的基团。. 2 关于酶与底物分子结合的假说. （ 1 ） . 中间络合物学说：底物先与酶结合成不稳定的中间络合物，然后再分解释放出酶与底物

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酶工程（二）

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  1. 酶工程（二）

  2. 四、酶催化反应机理及反应动力学

  3. （二）酶的催化反应机理 1 酶的活性中心 指酶分子中直接和底物结合，并和酶的催化作用直接有关的部位。 （1）结合基团：与S结合的基团。 （2）催化基团：直接参与催化反应的基团。 酶的活性部位，不仅决定酶的专一性，同时对E的催化性质起决定作用。 活性部位的基团都是必需基团，必需基团还包括活性部位以外的，对维持空间构象必需的基团。

  4. 2 关于酶与底物分子结合的假说 （1）.中间络合物学说：底物先与酶结合成不稳定的中间络合物，然后再分解释放出酶与底物 证实：H2O2 + 过氧化物酶 （H2O2 —过氧化物酶） （ 褐色）（ 红色） 645\587\548\498nm561\550nm （H2O2 —过氧化物酶）+ AH2 过氧化物酶+ A + 2H2O（ 红色） （ 褐色）

  5. （2）锁－钥匙学说：1890年Fisher提出。 该学说认为酶的天然构象是刚性的，如果底物分子结构上存在着微小的差别，就不能契入酶分子中，从而不能被酶催化。

  6. （3）诱导－契合假说:Koshland提出 当酶分子与底物接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生了有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。

  7. （三）酶催化反应的速率理论 基础知识： • 在反应体系中，任何反应分子都有进行化学反应的可能，但只有能量达到或超过某一限度（能阈）的活化分子，才能在碰撞中起化学反应。 • 能阈——活化能：活化分子处于活化态，活化态与常态的能量差，也就是分子由常态转变为活化态所需的能量称为活化能。 • 达到或超过能阈的分子——活化分子 • 活化分子越多——反应速度越快。 提高活化分子数量的途径 ①对反应体系加热，照射 ②降低活化能

  8. 2. 酶高效催化的理论 酶催化能够降低活化能，是非酶催化1/3以下。

  9. （1）邻近和定向效应 （2）酸碱催化 （3）张变和扭曲效应 （4）共价催化 （5）多元催化与协同效应

  10. （四）酶催化反应动力学 1 概念 • 热力学：研究一个反应能否进行，进行的程度（反应物转化成产物的多少），只考虑始态、终态，不考虑历程（如何反应）。 • 化学动力学：研究（1）反应速度（2）反应条件对速度的影响（3）反应步骤（4）反应机理（以便估价、控制、应用）。 • 酶促反应动力学：研究酶促反应的速度和影响此速度的各种因素以及反应历程。

  11. 2 底物浓度[S]对酶促反应速度V与底物浓度[S]的关系 Michaelis&Menten提出的著名的米氏方程 根据如下现象的观测 当底物浓度较低时候，反应速率与底物浓度成正比，即符合一级反应动力学；当底物浓度较高时，反应速率与底物浓度无关，即符合零级反应动力学 当酶的浓度大大小于底物浓度时，反应速率与酶的加入量成正比

  12. 根据中间络合物假说， Michaelis&Menten提出单底物酶催化的反应机理如下： 式中，E代表游离酶，ES为酶与底物的复合物；S为底物；P为产物；k+1,K-1,k+2为相应各步反应的反应速率常数。

  13. Michaelis&Menten进一步假设： • 与底物浓度[S]相比，酶的浓度[E]很小，因而可忽略由于生成中间复合物ES而消耗的底物 • 考虑反应的初始状态，此时产物P的浓度为零，可忽略反应的逆反应的存在 • 假设基元反应ES E+P的反应速率最慢，为上述步骤的控制步骤，而S+E ES的反应速率很快，可快速达到平衡状态。 在此基础二人提出了“米氏方程”： 其中Vmax是酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，单位为mol/L

  14. 3 温度对酶催化反应速率的影响 在Topt之前，T↑、V↑△T=10℃，反应速度增加1～2倍 在Topr之后，T↑、V↓ 注意： （1）动物体内最适T 一般30-50℃，植物40-60℃，有少数酶能耐较高的温度，如某些细菌中分离的DNA 聚合酶，最适温度可达70℃，细菌淀粉酶在93℃下活力最大。 （2）最适T，不是酶的特征常数，它与酶作用时间的长短、底物种类以及PH有关。

  15. 4 pH对酶催化反应速率的影响 每一种酶只能在一定pH 下才能表现酶反应的最大速度，高于或低于此值，反应速度都会下降，通常称此PH 值为酶反应的最适PH 值。 （1）一般酶最适PH4－8，植物5－6.5 动物6.5－8 （3）最适PH 与等电点不一定 例如： • 胰pr.E：Phopt=7.7～8.1 • 蔗糖E：pr.E：Phopt=3.0～7.5 • 胃pr.E：Phopt=1.5～2.2 酶有最适PH 的原因 （1）pH 影响E 结构的稳定性，过酸、过碱会强烈影响酶蛋白的构象，甚至使E 变 性失活。 （2）PH 影响E 分子上某些基团的解离状态 （3）PH 影响S 分子某些基团的解离状态。

  16. 5 激活剂对酶催化反应速率的影响 • 定义：凡能提高酶活的物质均为激活剂 • 种类： （1）无机离子： • 金属离子：K+、Na+、Ca2+、Mg 2+、Cu 2+、Zn 2+、Fe 2+、Mn 2+、Mo 2+。 • 阴离子：Cl—、Br— （2）有机小分子： Vc、Cys、GSH可使含E—SH处于还原态。

  17. 6. 抑制剂对酶催化反应速率的影响 1）抑制的作用 • 失活作用：凡使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。 • 抑制作用：使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的作用。（此作用使一部分酶的必需基团或辅助因子失活（活力变小））。 2）抑制类型 • 不可逆抑制：I 与E 共价结合，是一不可逆反应，二者结合后，不能透析除去抑制剂而恢复酶活力，称为不可逆抑制作用。 • 可逆抑制：I 与E 非共价结合，为可逆反应，透析能除去抑制剂使酶恢复活力，称为可逆抑制作用。

  18. 四 酶的固定化和固定化酶的反应器 （一）为什么要固定化酶 （二）酶固定化的优缺点 （三）酶的固定化方法 （四）固定化酶反应器

  19. （一）为什么要固定化酶 传统酶（自由酶）催化反应存在如下缺点 • 传统酶催化反应几乎都在水溶液中进行，只能一次性使用，难以回收 • 酶与产物混合，增加产物分离和纯化难度 • 溶液中酶的稳定性差，容易变形和失活。 而将酶固定化能够克服这些缺点。 相对于酶直接加入至溶液中，通常将固定化酶的制备过程称为酶的固定化。该项技术于20世纪60年代发展起来的，1971年第一届国际酶工程会议正式建议采用固定化酶的名称。

  20. （二）酶固定化的优缺点 1、酶固定化的优点： 固定化酶最大的特点就是既有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的特点： • 可以重复使用，在大多数情况下，稳定性明显提高 • 催化后，酶与底物容易分开，产物易于分离纯化，质量提高 • 反应条件易于控制，可实现反应的连续化和自动控制 • 酶的利用效率高了，单位酶量催化的底物浓度增加，而酶量减少 • 更适合于多酶催化反应

  21. 2、固定化酶的缺点 • 存在着酶失活现象，尤其是共价法固定 • 消耗固定化材料，增加成本 • 酶被固定到载体后将增加底物和产物的传质阻力 以此，考虑固定化酶的优缺点，在工业采用固定化还是液态的，应该根据具体情况分析而定。

  22. （三）酶的固定化方法 1 载体结合法：将水不溶性的载体与酶结合形成固定化酶的方法。 （1）物理吸附法：使酶直接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。常用的载体有: a 有机载体, 如面筋、淀粉等;b 无机载体, 如氧化铝、活性炭、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶等 （2）离子吸附法：此法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结合。此法在工业上应用较广泛, 常用的载体有: (1) 阴离子交换剂, 如二乙氨基乙基(DEA E)－纤维素等; (2) 阳离子交换剂, 如羧甲基(CM ) －纤维素、纤维素－柠檬酸盐等。

  23. （3）共价偶联法：将不溶性载体与酶蛋白以共价键形式结合成固定化酶的方法，包括重氮法、肽键法和烷化法等。（3）共价偶联法：将不溶性载体与酶蛋白以共价键形式结合成固定化酶的方法，包括重氮法、肽键法和烷化法等。

  24. 2、包埋法：包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内，格子的结构可以防止酶渗出到周围的培养基中，而底物分子仍能渗入格子内与酶接触。2、包埋法：包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内，格子的结构可以防止酶渗出到周围的培养基中，而底物分子仍能渗入格子内与酶接触。 又可分为：聚合物包埋法、疏水相互作用法、 微胶囊包埋法、脂质体包埋法

  25. 3、交联法 利用双功能或多功能试剂,使酶分子之间或酶蛋白与其它惰性蛋白之间发生交联,凝聚成网状结构,对酶行固定。戊二醛是应用最广泛的双功能试剂

  26. 六、酶工程的应用 • 酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。 • 另外在环境保护、能源开发上也有应用。

  27. 应用一：酶法生产高果糖酱 1：为什么要生产高果糖酱 果糖的甜度是葡萄糖的1.7倍，而且甜味纯正

  28. 2：需要用到的酶：淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶等2：需要用到的酶：淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶等 3：工艺流程示意图

  29. 应用二、酶法合成丙烯酰胺合成 1传统的丙烯酰胺合成生产及其缺点 传统丙烯酰胺合成合成：丙烯 腈与丙酮在催化剂浓硫酸 缺点：反应物浓度低，转化率低，反应物中残留金属铜合丙烯腈，影响产品质量 2 酶法合成丙稀酰胺 腈水合酶催化 条件温和、产率高，没有副产物 3. 酶法合成

  30. 应用三：酶法生产L-氨基酸 1 氨基酸的用途： 人体必须氨基酸：赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸 补充营养和治疗某些疾病 增味剂和畜禽的饲料 高分子材料：聚赖氨酸

  31. 化学合成——酶拆分方法 氨基酸酰化酶 1969 年，该酶被固定在DEAE-葡聚糖载体上，是世界上第一个固定化酶。

  32. 3 、酶法工艺生产L-氨基酸

  33. 应用四 酶法合成、半合成抗生素生产的重要中间体 1、酶法的好处： 发酵法存在一些缺点：抗菌谱窄、副作用大等。 而酶法则可生产抑制耐药性和新型广谱抗生素

  34. β-内酰胺环是青霉素的有效成分，若对青霉素分子进行改造，可通过三种途径，即更换侧链、改造羧基和改造母核，一般第一种较多。β-内酰胺环是青霉素的有效成分，若对青霉素分子进行改造，可通过三种途径，即更换侧链、改造羧基和改造母核，一般第一种较多。

  35. 2、合成过程：青霉素酰化酶

  36. 作业 • 酶作为生物催化剂有哪些特性 • 请简单列出微生物发酵生产酶制剂的工艺过程。

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