slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
MSc . Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa PowerPoint Presentation
Download Presentation
MSc . Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 46

MSc . Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa - PowerPoint PPT Presentation


  • 122 Views
  • Uploaded on

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR Á - UFC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA FACULDADE DE MEDICINA LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL. UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'MSc . Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa' - william-garza


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFC

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

FACULDADE DE MEDICINA

LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

FACULDADE DE MEDICINA

PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM MitracarpusBaturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS.

MSc. Igor da Silva Bomfim

Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa

Fortaleza/CE

2014

hist ria
História
  • Esqueletos de pessoas antiga Grécia, Egito e Chile – tumores malignos;
  • Diagnóstico câncer retal em uma múmia egípcia (DAVID & ZIMMERMAN, 2010)
  • Câncer (Grego - caranguejo)
    • Hipócrates – Grécia Antiga
  • Conjunto de doenças
    • Crescimento desordenado
    • Poder invasivo

http://www.thedailygreen.com

http://www.ciclodavida.com.br

(BROWN & ATTARDI, 2005)

c ncer
Câncer
  • 2ª causa de morte no mundo → Problema de saúde pública
  • Em 2008:

7,6 milhões de mortes (13 % do total) no mundo

70 % ocorreram em países de baixa ou média renda

  • Até 2020:

Cerca de 15 milhões de novos casos

60 % em países em desenvolvimento

Brasil – 518.510 novos casos (estimativa do INCA para 2012 e 2013)

Fonte: OMS 2008

brasil
Brasil

Fonte: INCA 2011

c ncer1
Câncer

“ Doença complexa caracterizada pela instabilidade genética de células que tem a capacidade de se multiplicar descontroladamente.”

ATIVAÇÃO

DE

ONCOGENES

PROGRAMAS CELULARES:

PROLIFERAÇÃO

MIGRAÇÃO

DIFERENCIAÇÃO

APOPTOSE

ALTERAÇÃO

SILENCIAMENTO DE GENES SUPRESSORES DE TUMOR

(HAHN & WEINBERG, 2002; LUO et al., 2009)

slide6

Carcinogênese

Expanção clonal –

câncer

Dano ao DNA – mutação

Céls. transformadas

Falha mecanismos

de reparo e na

maquinaria apoptótica

Agentes

Citotóxicos

Dano ao

DNA

Reparação de céls.

com menor intensidade

proliferativa

DNA reparado

Mecanismos de morte

funcionantes

Adaptado de ALLAN & TRAVIS, 2005

slide7

Apoptose

TIPOS DE MORTE CELULAR

Autofagia

PS

PS

PS

LC3

LC3

PS

PS

PS

Necrose

Catástrofe Mitótica

slide8

NECROSE

Alterações mitocondriais

Vacuolização

Inchaço

Célula normal

Perda da integridade de membrana

Extravasamento de mediadores inflamatórios

Desintegração de organelas

slide9

APOPTOSE

Formação de Blebs

Fragmentação internucleossomal do DNA

Diminuição do volume celular

Condensação da cromatina

Lise dos

corpos apoptóticos

Célula normal

Formação dos

corpos apoptóticos

slide10

Ações Importantes:

  • Promoção da saúde;
  • Detecção precoce;
  • Assistência aos pacientes;
  • Vigilância;
  • Formação de recursos humanos;
  • Comunicação e mobilização social;
  • Na pesquisa e gestão do SUS;
  • Desenvolvimento de tratamento mais eficazes.

http://www.tendenciasemercado.com.br/

terapias antic ncer
Terapias Anticâncer
  • Cirurgia
  • Radiação Ionizante
  • Imunoterapia
  • Terapia Dirigida
  • Quimioterapia

Remoção da massa tumoral

Mata rapidamente células tumorais em divisão,

incluindo células tumorais nos tecidos adjacentes

Terapia que se utiliza do sistema imune

para combater o câncer

Inibe especificamente os processos necessários para crescimento da célula tumoral

Mata rapidamente células em divisão

(tumorais e sadias)

KUMAR et al., 2004

quimioterapia
Quimioterapia
  • Definição:
    • Consiste em um tratamento a base de fármacos que interferem em diferentes processos tais como: desenvolvimento, crescimento, disseminação e invasão de células cancerígenas (Souza et al., 2007).
  • Objetivo primário:
    • Destruir células neoplásicas preservando células normais.
slide13

Produtos Naturais

Síntese Química

Plantas

Organismos Marinhos

Microorganismos

Papaver somniferum

Cryptotethya crypta

PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADE ANTICÂNCER

Penicillium notatum

drogas anti c ncer originadas de plantas

Vinca rosea

Taxus brevifolia

Camptotheca accuminata

Drogas Anti-câncer Originadas de Plantas
  • Derivados da Vinca
    • Vimblastina
    • Vincristina
    • Vindesina
  • Taxanos
    • Paclitaxel
    • Docetaxel
  • Camptotecinas
    • Topotecano
    • Irinotecano
  • Podofilotoxinas
    • Etoposídeo
    • Tenoposídeo
produtos naturais x derivados
Produtos Naturais x Derivados
  • Contudo há necessidade do desenvolvimento de novas drogas que reduzam os efeitos adversosdo tratamento;
  • O trabalho da química medicinaltem propiciado o surgimento de novos compostos, os quais tem levado a novos protótiposde drogas;

(MARKMAN, 1998)

produtos naturais x derivados1
Produtos Naturais x Derivados

Número de drogas

Derivados de prod. nat.

Produtos naturais

Nº de Drogas Aprovadas nos

EUA até 2007

anos

Adaptado de LI & VEDERAS, 2010

problem tica da quimioterapia
Problemática da Quimioterapia
  • Esquemas terapêuticos falhos;
  • Altos índices de recidivas;
  • Redução da sobrevida de pacientes;
  • Efeitos adversos;
  • Resistência
    • Inerente
    • Adquirida

http://www.mountnittany.org/wellness-library/healthsheets/documents?ID=4834

mitracarpus baturitensis sucre rubiaceae
Mitracarpus Baturitensis Sucre (Rubiaceae)
  • Utilizadas para tratamento:
  • Hanseníase
  • Cefaléia
  • Dor de dente
  • Doenças venéreas
  • Dispepsia
slide19

OBTENÇÃO DA MOLÉCULA FR42

  • Parte aérea seca (temp. Ambiente)
  • Triturada e submetida a extração exaustiva com hexano à frio seguida de EtOH.
  • Soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida.
  • Resultando: Extratos hexânicos e EtOH em gel de sílica

benzoisoquinolina-5,10-diona (FR42)

quinonas
Quinonas
  • Definição:Compostos oxigenados, formados a partir da oxidação de fenóis. Sua principal característica é a presença de 2 grupos carbonílicos formando um sistema conjugado.
  • Ampla e variada família de metabólitos de distribuição natural;
  • Amplo espectro de atividades biológicas:
    • Microbicida
    • Tripanossomicidas
    • Viruscidas
    • Antitumorais

naftoquinona

benzoquinona

antraquinona

slide22

MECANISMO DE AÇÃO DAS QUINONAS

Inibição de Topoisomerase

Geração de espécies reativas de oxigênio

objetivos
Objetivos
  • Geral:

Estudar o potencial citotóxico em células cancerígenas e os prováveis mecanismos de açãoda FR42 (benzoisoquinolina), isolada do Mitracarpus baturitensis, em ensaios in vitro.

objetivos1
Objetivos
  • Epecíficos:
  • Determinar a IC50da FR42 em um painel de linhagens celulares cancerígenas: através do ensaio de MTT. Além de células normais CMSP através do ensaio Alamar Blue.
  • Definir a citotoxicidade da FR42 sobre as células SF-295, através do ensaio de citotoxicidade em tempo real (XCELLligence)
  • Avaliar o provável mecanismo de ação da FR42 através de citometria de fluxo (integridade de membrana, fragmentação de DNA, despolarização mitocondrial) a partir de células SF-295 (glioblastoma humano) tratadas com a benzoisoquinolina.
manuten o das linhagens celulares

Repique em meio de cultura novo

Manutenção das Linhagens Celulares

10mL

Cultura de células

37°C / 5% de CO2

  • Meio de cultura RPMI 1640;
  • 10 ou 20% de soro fetal bovino;
  • 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina);
  • 3% de fitohemaglutinina (linfócitos).

Contagem/Observação

ensaio de citotoxicidade em c lulas tumorais e n o tumorais teste mtt

Cultura de células

Células plaqueadas e drogas diluídas

usando o HTS (Highthroughputscreening)

Formasan

0,039 a 5µg/mL

MTT

72 h

3 h

Absorbância em 595nm

Ensaio de Citotoxicidade em Células Tumorais e Não Tumorais – Teste MTT

Contagem

slide28

Formazan

Doadores de e-

Redução

Succinato

NADH

NADPH

+

MTT

Citoplasma

meio extra-celular

Berridge & Tan, 1993

slide29

TESTE DE CITOTOXICIDADE EM CMSP

ENSAIO DO ALAMAR BLUE

Princípio: Baseia-se na redução do alamar blue ou resazurina (azul e não fluorescente) por células viáveis à resorufina (róseo e altamente fluorescente), mensurando indiretamente a proliferação celular.

Forma oxidada

Forma reduzida

slide35

CITOMETRIA DE FLUXO

Diluição com

Corante desejado

FR42

48 h

Células SF-295

slide36

Viáveis

Não Viáveis

CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS

Princípio: Baseia-se na capacidade de o iodeto de propídeo penetrar as células cuja membrana esteja rompida e ligar-se ao DNA nuclear, emitindo alta fluorescência vermelha.

Iodeto de propídeo

não ligado

Iodeto de propídeo ligado

slide38

G1

G2/M

DNA

Fragmentado

CICLO CELULAR E FRAGMENTAÇÃO DO DNA

DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE DNA

Princípio: Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA. Assim, pode-se determinar as diferentes fases do ciclo celular, baseando-se pelo conteúdo de DNA.

Quantidade de DNA

por núcleo

S

4n

2n

G1

S

G2

Interfase

Mitose

slide41

POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA

Princípio: Seqüestro da rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, para dentro da mitocôndria quando esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado, emitindo, assim, alta fluorescência.

Despolarizadas

Polarizadas

microscopia confocal
Microscopia Confocal

SF-295

Tratar com os compostos testes

24h

24h

20.000 céls/poço

Aspirar o meio e resuspender com 200 uL de meio novo

Adicionar 4 uL da Anexina V/AlexaFluor568

Resuspende com 200 uL de meio novo

Lavar com PBS

15 min – temp. ambiente

Hoechst – 10 min

externaliza o da fosfatidilserina anexina v alexa fluor 564
Externalização da fosfatidilserina – Anexina V/AlexaFluor 564

A

B

Vermelho: Anexina V/AlexaFluor 568

Azul: Núcleo/Hoechst33342

C

D

A

Cont. Negativo (DMSO)

B

Doxorrubicina 0,3 uM

C

Droga 4 uM

D

Droga 8 uM

Escala: 50 UM