Download
1 / 38
390 likes | 570 Views
DNA 抽取和质粒 DNA 制备. 提取 DNA 总的原则. 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如 RNA， 也应尽量去除。. 核酸分子抽提的技术设计. 核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法中 溶胞法 是应 用最广泛的方法） 核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂
E N D
提取DNA总的原则 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
核酸分子抽提的技术设计 核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应 用最广泛的方法） 核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液
核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
鉴定与保存 （一）核酸的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定
浓度鉴定 1紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260×稀释倍数×50＝ μg/ml 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。 (A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA， 40μg/ml单链DNA或RNA，33 μg/ml单链寡核苷酸）
2 荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）
纯度鉴定 1 紫外分光光度法： 在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。 A260与A280之比应在1.80；纯的RNA A260与A280之比应在2.0。 A260/A280比值是纯度检测的重要指标。
2 荧光光度法 • 核酸电泳结果进行评定。
完整性鉴定 凝胶电泳法： 基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。
正常时，28S RNA的荧光强度约为18S RNA的2倍，否则提示RNA的降解
核酸的贮存——DNA保存 1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。
核酸的贮存——RNA保存 • RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70℃保存。 • RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20 ℃保存。 • RNA如果以DEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制RNA酶对RNA的降解
DNA样品准备 常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 － 70℃或液氮
DNA提取 1 酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。
主要试剂的作用： EDTA：1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2 降低细胞膜的稳定性
SDS的作用： 1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂； • 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来； 3 对RNA、DNA酶有抑制作用； 4 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，使蛋白质变性。
蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用。
酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。 • PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。 • 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。
2 甲酰胺解聚法： • 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 • 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。
3 玻璃棒缠绕法： • 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
4 异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）。 • 5 表面活性剂快速制备法：用Triton X-100或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
DNA样品的纯化：透析、层析、电泳及选择性沉淀。DNA样品的纯化：透析、层析、电泳及选择性沉淀。 • 电泳法简单、快速，是DNA样品纯化最重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳。PAGE分辨率高，适用于5-500bp大小的片段。
琼脂糖含量％（W/V）线性DNA分离范围（Kb） 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 - 3 2.0 0.1 – 2
DNA的浓缩 • 1、 固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量。 • 2、 丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。
DNA的检测 溴乙锭染色 ：在254nm紫外光下检测，如需回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。 银染法 ：Ag+与DNA形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高200倍，但不能回收。
DNA分析 通常与已知分子量的标准DNA片段一起电泳，经比较可获知DNA标本大小，如条带拖尾，系加入DNA量太多或凝胶未制好，如分子量小或一片糊状，表示DNA有降解。
DNA回收 主要是从电泳中分离回收DNA片段。 回收原则：尽量提高回收率 去除回收DNA样品中的污染物
电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的DNA分子。 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。
透析袋电洗脱 ： 切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。
低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到65℃熔化胶，然后抽提回收DNA。 方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。
玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。
